ابدأ بالتريبسين في الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية لإنشاء معلق خلوي. بعد ذلك ، قم بقسمة تعليق الخلية في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لإنشاء 10 تركيبات. بعد الطرد المركزي للتعليق عند 220 جم لمدة ثلاث دقائق ، استخدم مضخة تفريغ لإزالة المادة الطافية.
الآن ، ضع بيليه الخلية على الجليد. بعد ذلك ، أحضر حمض الهيالورونيك المعدل بالثيول ، والتشابك المتفاعل مع الثيول ، والبولي إيثيلين جلايكول دياكريلات ، وزجاجات المياه المنزوعة الغازات إلى درجة حرارة الغرفة. في ظل ظروف معقمة ، استخدم حقنة مجهزة بإبرة لإضافة ملليلتر واحد من الماء المنزوع الغاز إلى الزجاجة التي تحتوي على حمض الهيالورونيك.
دوامة الحل ، وتسخينه في بعض الأحيان إلى 37 درجة مئوية حتى يصبح واضحا. ثم ضع المحلول على الجليد. في ظل ظروف معقمة ، أضف 5 ملليلتر من الماء المنزوع إلى زجاجة crosslinker.
يذوب عن طريق التقليب بشكل متكرر قبل وضعه على الثلج. الآن ، أضف 120 ميكرولترا من محلول حمض الهيالورونيك المذاب إلى حبيبات الخلية المقتبسة وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب المحلول ذهابا وإيابا. أضف 30 ميكرولترا من محلول التشابك المذاب في الأنبوب باستخدام حبيبات الخلية المعاد تعليقها.
تأكد من الخلط السليم من خلال النقر على الأنبوب. بعد الخلط ، قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة. قم بإسقاط 15 ميكرولترا من المحلول المدمج على صفيحة 24 بئرا مغلفة بالبارافين.
اتركه يتجمد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. للتمايز في المختبر ، أضف 0.5 ملليلتر من وسط التمايز الغضروفي إلى الهلاميات المائية الموجودة في الخلية. بعد ثلاثة أسابيع ، قم بالتبديل إلى وسط التمايز الضخامي ، مضيفا 0.5 ملليلتر لكل بئر.
أدى التمايز الغضروفي إلى الجليكوزامينوجليكان الكبريتي في مصفوفة الكولاجين خارج الخلية الإيجابية من النوع 2 في كل من حمض الهيالورونيك أو HA وتركيبات الكولاجين. ومع ذلك ، كان التوزيع أكثر تجانسا في تركيبات حمض الهيالورونيك. أظهرت تركيبات الكولاجين خلايا محيطية ذات مورفولوجيا غير متجانسة.
كان متوسط استدارة الخلايا في تركيبات HA أعلى منه في تركيبات الكولاجين. تم الكشف عن ترسب الكالسيوم عند الحواف الخارجية لكلا البنائين في خمسة أسابيع. في تركيبات HA في الجسم الحي ، تم ربط جميع الغرسات ببعضها البعض في جيوب تحت الجلد وشكلت أنسجة عظمية متكاملة.
40٪ من تركيبات الكولاجين في الجسم الحي كانت مستقلة. تم تشكيل الأنسجة العظمية مع مورفولوجيا رقائقي في المناطق الخارجية لكليهما في التركيبات الحية في ثمانية أسابيع بعد الزرع. كما لوحظ فقدان الغضروف في بناء HA.
يبدو أن تركيبات HA المتعددة في الجسم الحي تشكل أنسجة عظمية متكاملة كما يتضح من الاتصال بأنسجة العظام ووجود الأنسجة الليفية المشتركة. في حين أن 40٪ من تركيبات الكولاجين كانت متحدة ، فإن التركيبات المتبقية كانت موجودة منفصلة أو كانت متصلة فقط بدون وصلات الأنسجة العظمية. أظهر كلا البنائين أوعية ذات علامات إيجابية في نخاع العظم ، وكان الغضروف الداخلي محاطا بخلايا ناقضة العظم متعددة النوى.
تم ترسيب المعدن في المنطقة العظمية الخارجية لكلا البنائين مع حجم معدني أعلى وتركيبات HA بسبب حجمها الأكبر.
