للبدء ، قم بإعداد الأوراق الأربع من ورق الترشيح ، كل منها بقياس 12.5 × 7.5 سم. قم بتكديس ورقتين معا وضع المكدس في مخزن مؤقت للنقل لامتصاصه. ضع غشاء PVDF في 95٪ إيثانول وحرك الغشاء على الروك لمدة دقيقة واحدة.
تذكر الإيثانول. اغمر الغشاء في المخزن المؤقت للنقل. ويحرض لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، ضع كومة ورق الترشيح المبللة على سطح مستو ومتحرك ، مثل غطاء كبير وقم بتسويتها باستخدام الأسطوانة. باستخدام محرر هلام أو ملاقط ، ضع غشاء PVDF بعناية على المكدس. بعد ذلك ، ضع ورقة واحدة من ورق الترشيح الجاف على هذا الغشاء وحرك الأسطوانة فوق الورق لامتصاص أي مخزن مؤقت زائد موجود على سطح الغشاء.
ارفع ورق الترشيح العلوي دون احتكاكه بالغشاء. خذ عينات ألياف معزولة من الفريزر وقم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة قبل الطرد المركزي وإعادة تعليق العينة تماما. ضع قطرة ميكرولتر واحدة من كل عينة في وسط منطقة الغشاء المحددة.
تجنب لمس الغشاء بطرف الماصة. اترك قطرات العينة تمتص بالكامل في الغشاء لمدة 15 دقيقة. ثم باستخدام محرر هلام أو ملاقط ، ارفع الغشاء بعناية من كومة ورق الترشيح الرطبة.
ضعه على ورقة جافة من ورق الترشيح واتركه لمدة خمس دقائق على الأقل حتى يجف. أعد تنشيط الغشاء بعد أن تتحول بقع العينة إلى اللون الأبيض تماما. ثم المضي قدما في وضع العلامات المناعية على البروتين المستهدف.
تعرف على كيفية استخدام شدة لوحة الإشارة لتصنيف شدة الأشكال المتساوية MHC وإشارات الأكتين من صور اللطخة النقطية. يظهر الكشف عن البروتين المستهدف القوي والمتوسط والقليل من خلال الإشارات المشبعة والمعتدلة والخافتة على التوالي. لتحديد نوع الألياف ، قارن في البداية سلسلة الميوسين الثقيلة IIA وسلسلة الميوسين الثقيلة نتائج واحدة.
قم بتوثيق الألياف التي تعرض فقط شكلا متساويا واحدا من سلسلة الميوسين الثقيلة مع شدة إشارة مشبعة أو معتدلة. سجل الألياف المكتشفة باستخدام الأكتين وعدم اكتشاف سلسلة الميوسين الثقيلة الأولى أو IIA كنوع محتمل 2X. إذا كانت إشارة متساوية السلسلة الثقيلة للميوسين باهتة موجودة مع إشارة أكتين معتدلة غير مشبعة ، فقم بتسجيلها على أنها مجهولة الهوية.
تخلص من العينات التي تحتوي على بروتينات مستهدفة باهتة أو غير مكتشفة. لا ينبغي استخدام الألياف التي تعرض إشارات مشبعة أو معتدلة لكل من MHCIIA و MHC1 لإعداد نوع الألياف المحددة. بعد معرف MYO1D ، قم بإعداد عينات من النوع الأول والثاني من خلال الجمع بين الألياف والإشارات المشبعة أو المعتدلة لشكل MHC المعني.
استخدم 10 ميكرولتر من كل عينة خاصة بنوع الألياف وافصلها على هلام مسبق الصب بواسطة صفحة SDS ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. استخدم جهاز تصوير جل للكشف عن الشكل المتماثل MHC المستهدف ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. قارن شدة الإشارة لكل شكل متساوي MHC في جميع العينات الخاصة بنوع الألياف.
يتم تأكيد معرف نوع الألياف بواسطة الشكل المتماثل الصحيح MHC عند شدة إشارة معتدلة أو مشبعة. سمح وضع العلامات المناعية للبقعة النقطية بتحديد الألياف من النوع الثاني والألياف من النوع الأول والألياف المحتملة من النوع 2X. تم التحقق من صحة العينات الخاصة بنوع الألياف ، باستخدام النشاف الغربي والأجسام المضادة الخاصة بسلسلة الميوسين الثقيلة.
