للبدء ، استخدم مقصا أو مقصات شديدة التحمل لقطع طرف الغطاء 0.5 ملم من القاع المخروطي لأنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. ضع قطعة من الصوف الزجاجي في الأنبوب المقطوع لتغطية الفتحة المركزية. ضع وحدة تصفية واحدة مجمعة من الصوف الزجاجي في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر وقم بتسمية الأنبوب.
بعد ذلك ، قم بقص لوحة PCR غير ذات 96 بئرا إلى ستة رفوف دعم ذات عمودين. اقلب الرفوف ذات العمودين بحيث تكون القيعان المخروطية للآبار متجهة لأعلى. ضع الرف في طبق بتري زجاجي يحتوي على ورق ترشيح رطب وقم بتغطيته بالغطاء لإنشاء غرفة رطوبة لأغلفة الأوراق.
لحصاد الكونيديا من Colletotrichum graminicola sporulating ، أضف ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات المعقم في اللوحة. باستخدام مدقة طرف مخروطي معقمة ، اكشط بالتساوي عبر اللوحة بأكملها لفك الجراثيم من الآجار. أضف ملليلتر واحد من معلق البوغ بشكل معقم إلى وحدة مرشح من الصوف الزجاجي واسمح للجراثيم بالتدفق إلى أنبوب التجميع عن طريق الجاذبية.
أجهزة الطرد المركزي تعليق بوغ المصفى في 3،500 غرام لمدة خمس دقائق وسكب السائل في حاوية autoclavable. أضف ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات المعقم إلى أنبوب التجميع وحركه برفق لإعادة تعليق الجراثيم المحببة. مرة أخرى ، قم بطرد مركزي التعليق وإعادة تعليق الجراثيم للقياس الكمي في 300 إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
استخدم مقياس الدم تحت المجهر المركب بتكبير 100 مرة لتحديد تركيز البوغ. ثم تحضير 500،000 جراثيم لكل تعليق ملليلتر بالماء منزوع الأيونات. لإزالة الغمد من الورقة الحقيقية الأولى من شتلات الأسبوع الثاني.
قم بتشغيل صورة مصغرة على طول الهامش المتداخل للغلاف وقم بفكها برفق من المزلق. قطع غمد الورقة المستردة إلى ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات. قم بفك كل جزء بعناية لكشف طبقة البشرة الداخلية.
ضع 20 ميكرولترا من تعليق البوغ الفطري على السطح الداخلي في وسط الغمد فوق منتصف الضلع. ضع أغلفة الأوراق الملقحة أفقيا ، مع وضع ضلع متوسط في الأسفل ، في صفيحة بتري زجاجية تحتوي على ورق ترشيح مبلل. بعد ذلك ، ضع غرف الرطوبة الصغيرة في صندوق تخزين شفاف مبطن بورق إنبات مبلل ، وقم بتغطية صندوق التخزين بغطاء ، واحتضانه عند 23 درجة مئوية تحت الإضاءة المستمرة للدورة الزمنية المقصودة.
تحقق بانتظام من المربعات بحثا عن علامات المرض على الأغماد.
