Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

للبدء ، بمشرط ، قم بعمل شق على طول خط الوسط الظهري للفأر الرحيم من القذالي إلى المنطقة المقدسة. باستخدام المجهر الجراحي المجسم ، تشريح بعناية من خلال طبقات حتى العمود الفقري القطني. تحديد القوس الساحلي الأخير.

تحديد آخر فقرة عنق الرحم والعجز. ثم قم بعمل قطع لفصل العمود الفقري. باستخدام زوج من ملقط التشريح ، قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية للفقرة لاستخراج الحبل الشوكي.

إزالة الأعصاب الناشئة من خلال الثقبة التي تشكل الجهاز العصبي المحيطي. الآن ، ضع الحبل الشوكي المستخرج على لوح تشريح. مع زوج من مقص فانا ، قم بتقطيعه إلى قطع بحجم 2 ملليمتر.

ثم انقل القطع إلى أنبوب صغير مسطح القاع سعة 2 ملليلتر. أضف ملليلتر واحد من محلول عمل HBSS-LD إلى الأنبوب الصغير. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.

تأكد من دوامة الخليط بقوة كل خمس دقائق. بعد ذلك ، مرر محتويات كل عملية هضم من خلال مصفاة بحجم 40 ميكرون. ثم أضف سبعة ملليلتر من HBSS مع 2٪ FBS لتحييد الهضم وسحق الأنسجة المتبقية.

انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر قبل الطرد المركزي عند 220 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. الآن استخدم ميكروبيت واحد ملليلتر للتخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من HBSS-FBS في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر.

أضف ملليلتر من وسط التدرج بكثافة متساوية التوتر بنسبة 90٪ إلى الأنبوب ، وطرد مركزي الخليط عند 160 جم لمدة 25 دقيقة عند 18 درجة مئوية. أخيرا ، باستخدام ماصة النقل ، استرجع الطور البيني وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، ثم طرد الخلايا عند 220 جم لمدة خمس دقائق عند خمس درجات مئوية قبل إجراء مزيد من التجارب.

أسفرت تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة المستخرجة عن ما يصل إلى 99٪ من إنتاج الخلايا كما أكد تلطيخ FACS. لوحظت خلايا إيجابية مزدوجة بمتوسط حجم 10 ميكرومتر تتفق مع الخلايا الدبقية الصغيرة غير النشطة.