للبدء ، قم بحقن الماوس بناقلات مرتبطة ب AAV في دماغ الفأر. بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من حقن الفيروس ، احلق المناطق البطنية والخلفية من عنق الفأر المخدر. نظف المناطق المحلوقة باستخدام ثلاثة مقشرات باليود بالتناوب بمحلول إيثانول 70٪.
قم بعمل شق بطني في الجلد بين لوحي الكتف. بعد ذلك ، ضع شاشا جراحيا فوق الشق وضع في حالة ضعيفة ، مع توجيه رأسه نحو الجراح. ثم قم بعمل شق عمودي صغير على الجانب الأيمن من الرقبة ، فوق الترقوة ، لكشف الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي.
بعد فصل الأنسجة تحت الجلد ، فضح الوريد الوداجي الخارجي الأيمن وضع الخيط تحت الوريد. اربط الطرف البعيد للوريد الوداجي لوقف تدفق الدم. باستخدام ملقط ومقص دقيق ، قم بعمل شق صغير في الوريد المنهار.
الآن ، أدخل القسطرة الوريدية بحيث يكون المخروط متجها لأسفل ، وحركه بالقرب من الوريد الأجوف العلوي حتى يصل إلى الأذين الأيمن. باستخدام خياطة الحرير 7-0 ، قم بتأمين القسطرة بالوعاء. تشريح الأنسجة الضامة لكشف الشريان السباتي المشترك الأيمن.
بالقرب من ذلك ، ضع مسبقا حلقتين من الغرز الحريرية 7-0 التي تظل غير مثبتة على المستوى الذي تنقسم فيه الشرايين السباتية الداخلية والخارجية. لإيقاف تدفق الدم مؤقتا ، اسحب حلقة خياطة موضوعة مسبقا. ثم ، باستخدام مقص صغير أو إبرة قياس 27 ، قم بإنشاء فتحة صغيرة على جدار الوعاء.
أدخل القسطرة الشريانية بالقرب أثناء تحرير حلقة الخياطة ، وقم بدفع القسطرة للوصول إلى قوس الشريان الأورطي ، دون لمس الصمام الأبهري. استخدم الغرز الموضوعة مسبقا لربط القسطرة بالوعاء. نفق جميع القسطرة تحت الجلد ، وقم بإخراجها من الجزء الخلفي من الرقبة عن طريق شق مقطوع مسبقا ، وأغلق الشق البطني.
قم بتوصيل القسطرة بالمنافذ الوريدية أو الشريانية لموصل الأنبوب المطلي بالسيليكون المصنوع من أنابيب إبرة قياس 25. بعد إغلاق الشق البطني ، قم بتأمين الموصل تحت الجلد عندما يتم إغلاق الجلد الخلفي بالغرز. باستخدام أسلاك جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ ، املأ القسطرة بمحلول ملحي هيبارين وقم بتوصيل نهايات القسطرة بإحكام.
لإرفاق بنظام آلي لجمع الدم بعد 24 ساعة من الجراحة ، قم بتوصيل خطاف الحبل بالحلقة المعدنية الموجودة في الجزء الخلفي من الرقبة وتوصيل الخط الشرياني. بمجرد توصيل القسطرة الشريانية بخط الحقن ، قم بتوصيل القسطرة الوريدية بخطوط أخذ العينات. اضبط وقت الحقن والجرعة على 0.5 ملليغرام لكل كيلوغرام عند 500 ميكرولتر في الدقيقة.
اضبط وقت أخذ عينات الدم وتكرارها ، بما في ذلك تخفيف العينة بالمحلول الملحي. سيقوم النظام تلقائيا بتجديد كمية متساوية من المحلول الملحي لتحل محل عينة الدم. إجراء الحقن المسبق الآلي.
بعد ذلك ، قم بإجراء حقن آلي في الوريد لعقار كلوزابين N-oxide بمعدل حقن 500 ميكرولتر في الدقيقة. ثم قم بأخذ عينات الدم بعد الحقن. يتم تقديم أنماط هرمون اللوتين في الإناث البالغات Kiss1-EYFP التي تلقت حقنة مجسمة من جانب واحد من AAV-hM3Dq-mCherry في النواة المقوسة.
مستويات هرمون Diestrus luteinizing منخفضة بشكل عام ، ولكن عادة ما يتم ملاحظة الاختلافات بسبب إطلاقه النابض. يحدث ارتفاع حاد في مستويات هرمون اللوتين استجابة لحقن كلوزابين N-oxide. أظهرت معظم الخلايا العصبية mCherry المترجمة مع Kiss1-EYFP أن التنشيط الفيروسي والعصبي خاص بالسكان المستهدفين.
يظهر نمط نابض للهرمون اللوتيني للإطلاق في الفئران من النوع البري diestrus ، متبوعا بالاستجابة لحقن IP من Kisspeptin-10. لوحظت نبضات هرمون اللوتين الصافي ، النموذجية للإناث في الديسترو ، والتي تظهر انخفاض مستويات هرمون اللوتين القاعدي. تم الكشف عن زيادة فورية وقوية في هرمون اللوتين استجابة لإدارة كيسبيبتين.
