للبدء ، فإن hiPSCs المزروعة في وسط صيانة IPSC على صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار مغلفة بعامل نمو يقلل من هلام المصفوفة خارج الخلية. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ فولت ، قم بإزالة الوسط من اللوحة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS. ثم أضف 700 إلى 800 ميكرولتر من 0.48 مليمول EDTA واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة محلول الهضم واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. عندما يتم هضم الخلايا في صفائح ، أضف ملليلتر من وسيط صيانة IPSCs لإنهاء عملية الهضم. انقل تعليق الخلية إلى لوحة تثبيت منخفضة بستة آبار.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 60 دورة في الدقيقة لتشكيل أجسام جنينية كروية أو EBs. بعد 24 ساعة ، باستخدام ماصة سابقة ، انقل EBs إلى أنبوب الطرد المركزي واتركه يترسب لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل إزالة المادة الطافية. أضف وسيط تمايز MSC إلى الأنبوب وانقل EBs إلى شفرة تثبيت منخفضة من ستة بئر مع ملليلتر من وسيط تمايز MSCs.
استزرع EBs على شاكر عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة سبعة أيام. في اليوم الثامن ، انقل EBs إلى أنبوب الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. بمجرد ترسيب EBs ، قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب.
أضف وسيط صيانة MSC إلى الأنبوب وانقل EBs إلى عامل نمو مخفض من هلام المصفوفة خارج الخلية مطلي بستة آبار مع ملليلتر من وسيط صيانة MSC. بعد التصاق الخلية ، قم بتغيير الوسط حتى تصل الثقافة إلى التقاء 90٪. بعد ذلك ، تعامل مع الثقافة المشتقة من EB بمحلول تفكك عند 37 درجة مئوية.
عندما يتم هضم جزء من الخلايا في خلايا مفردة ، أضف ملليلتر من وسيط صيانة MSC لإنهاء عملية الهضم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي. اغسل الخلايا المتبقية غير المهضومة من الآبار مرة واحدة باستخدام DPBS. وهضم مرة أخرى كما هو موضح سابقا.
ثم الطرد المركزي تعليق الخلية في 250g لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وزرع الخلايا في صفيحة ثقافة مغلفة بالجيلاتين. استزراع الخلايا في متوسط صيانة MSC إلى التقاء 90٪ مع تغيير متوسط منتظم.
خطوط hiIPCs الثقافة كما هو موضح سابقا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 50 إلى 60٪ ، قم بإزالة وسيط صيانة IPSC من اللوحة. أضف ملليلتر من وسيط صيانة MSC.
والثقافة لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع تغيير متوسط يومي. لنضوج MSCs ، تعامل مع الثقافة أحادية الطبقة بمحلول تفكك عند 37 درجة مئوية. عندما يتم هضم جزء من الخلايا في خلايا مفردة ، أضف ملليلتر من وسيط صيانة MSC إلى الآبار لإنهاء الهضم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي.
اغسل الخلايا المتبقية غير المهضومة مرة واحدة باستخدام DPBS وهضمها كما هو موضح سابقا. ثم قم بطرد مركزي تعليق الخلية كما هو موضح سابقا وزرع الخلايا على طبق استزراع مطلي بالجيلاتين. استزراع الخلايا في متوسط صيانة MSC إلى التقاء 90٪ مع تغيير متوسط منتظم.
في طريقة تكوين EB ، أظهرت مستعمرات hiIPCs مورفولوجيا مضغوطة قبل التمايز. بعد التفكك ، تشكلت EBs كروية موحدة ، والتي جذبت الحجم بمرور الوقت. بعد ذلك ، تحولت EBs إلى خلايا أحادية الطبقة ملتصقة تحقق التقاء بنسبة 90٪ بحلول اليوم 18 وتكتسب مورفولوجيا شكل المغزل بعد مقطعين.
وبالمثل ، في طريقة الطبقة الأحادية ، تكاثرت الخلايا لتشكيل خلايا ملتصقة متعددة الطبقات. بعد التعبئة عدة مرات ، نضجت الخلايا في MSC بشكل مغزل نموذجي ومستعمرة دوامة. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن hiIPCs كانت إيجابية ل CD90 وسلبية ل CD34 و CD45 و CD105 و CD73.
بعد التمايز ، عبرت hiIPCs التي تقود MSCs عن CD90 و CD73 و CD105 ، بينما ظلت سلبية ل CD34 و CD45. أظهرت MSCs المشتقة أحادية الطبقة تكوين رواسب الكالسيوم أعلى من طريقة EB. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في قدرات التمايز الدهنية والغضروفية.
تم الحفاظ على قدرات الانتشار لكلتا الطريقتين لمدة تصل إلى 20 مقطعا.
