للبدء ، قم بإزالة الثرب البشري الذي تم استئصاله حديثا من حاوية التجميع داخل غطاء التدفق الصفحي. اغمر الثرب في برنامج تلفزيوني لغسل أي دم أو حطام متبقي برفق. باستخدام مشرط وملقط ، وقطع الأنسجة إلى قطع.
ضع قطع الثرب في آبار فردية للوحة استزراع مكونة من 24 بئرا. ثم املأ الآبار ب 500 ميكرولتر من وسائط زراعة الثرب. أضف 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم إلى دورق مزرعة يحتوي على 75٪ من خلايا سرطان المبيض البشرية الإيجابية mCherry المتكاملة.
هز القارورة برفق لغسل الخلايا. قم بإزالة برنامج تلفزيوني وأضف ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ تربسين EDTA. هز قارورة الثقافة برفق مرة أخرى لتوزيع التربسين EDTA بالتساوي على الخلايا المرفقة.
ثم ضع القارورة في حاضنة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. الآن اضغط على قارورة الثقافة لفصل الخلايا تماما.
ثم أضف ثلاثة ملليلتر من وسائط زراعة الثرب لتحييد التربسين. ماصة تعليق الخلية عدة مرات لخلطها جيدا. نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 1،200 G لمدة خمس دقائق عند 24 درجة مئوية. الآن ماصة من طاف وإعادة تعليق بيليه الخلية في ستة ملليلتر من وسائط زراعة الثرب الطازجة. خذ 10 ميكرولترات من معلق الخلية لحساب عدد الخلايا باستخدام عداد خلية.
تمييع تعليق الخلية مع وسائط ثقافة جديدة إلى الكثافة المطلوبة. باستخدام حقنة واحدة ملليلتر ، ارسم تعليق الخلايا السرطانية. نعلق إبرة قياس 26 إلى حقنة.
الآن استخدم زوجا من الملقط الجراحي الصغير لالتقاط قطعة من الثرب المقطوع ووضع قطعة الثرب في طبق معقم منفصل. ثم حقن حوالي 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في الأنسجة. بدلا من ذلك ، امزج كميات متساوية من مصفوفة الغشاء القاعدي المذاب مع ثقافة الثرب.
ضع الخليط على الثلج حتى الحقن. بعد غمر قطع الثرب في مزيج المصفوفة في آبار صفيحة الاستزراع ، احتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة.
بمجرد أن يتجمد الخليط ، احقن قطع الثرب بالخلايا السرطانية. تأكد من الحقن الناجح للخلايا السرطانية باستخدام التصوير بالفلورسنت. يمكن رؤية خط من إشارة الفلورسنت في مواقع الحقن كتأكيد.
لتسهيل الزراعة المشتركة للثرب والخلايا السرطانية ، أضف 500 إلى 200 ميكرولتر من الوسائط الطازجة كل 48 إلى 72 ساعة. أخيرا ، باستخدام مجهر الفلورسنت ، راقب نمو أورام سرطان المبيض. قد يكون نمو الورم مرئيا في غضون أسبوعين.
تم دمج خلايا سرطان المبيض بنجاح في قطع الثرب بحلول اليوم 14. انتشرت الخلايا السرطانية في البداية عبر سطح الثرب في الأسبوع الأول. بمرور الوقت ، تجمعت الخلايا لتشكيل الأورام.
تم تأكيد عبء الورم من خلال تغيير لون وسائط الثرب ، والتي تحولت من الأحمر إلى الأصفر.
