للبدء ، أضف ثمانية ملليلتر من DPBS في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر. لهذا ، أضف ثمانية ملليلتر من الدم واستخدم ماصة باستور بلاستيكية سعة ثلاثة ملليلتر لخلط المحتويات جيدا. أضف 15 ملليلترا من وسط عزل الخلايا الليمفاوية في أنبوب مخروطي آخر.
قم بإمالة الأنبوب بمقدار 20 إلى 30 درجة. ثم استخدم ماصة باستور ثلاثة ملليلتر لتطبيق الطبقة الأولى من مزيج DPBS في الدم برفق على وسط العزل. ضع الخليط المتبقي بعناية على الجدار الجانبي للأنبوب.
ضع الأنبوب ببطء في وضع رأسي لوضع الدم المتبقي على طبقة الدم. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 1000 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في دلو متأرجح مع إيقاف تشغيل الفرامل. سيتم فصل مزيج PBMC في الدم إلى أربع طبقات متميزة.
باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة ثلثي طبقة البلازما ، ثم استخدم ماصة واحدة ملليلتر لجمع PBMCs. انقل PBMCs إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر حتى يتم حصاد الطبقة بأكملها. ثم اجعل الحجم يصل إلى 25 ملليلتر باستخدام DPBS لإزالة وسط العزل المتبقي والمخلفات الأخرى.
جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 100 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تشغيل الفرامل. ثم قم بإزالة المادة الطافية بمضخة تفريغ. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد DPBS وأضف المزيد من DPBS لتعويض الحجم إلى 25 ملليلتر لغسل الحبيبات وإعادة تعليقها.
تبريد وعاء تجميد إلى أربع درجات مئوية. ثم ضع مصل الجنين البقري على الجليد. أعد تعليق حبيبات الخلية التي تحتوي على PBMCs المعزولة في ملليلتر واحد من مصل الجنين البقري.
بعد ذلك يخلط DMSO مع مصل مبرد على الجليد بنسبة واحد إلى خمسة. انقل معلق الخلية إلى أنبوبين كريديين ملليلتر ، باستخدام أنبوب واحد لكل أنبوب تجميع. باستخدام عداد الخلايا الآلي ، حدد عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
استخدم ماصة ملليلتر واحد لإسقاط ملليلتر واحد من خليط DMSOFBS في الأنبوب. ثم ضع الأنابيب في حاوية التجميد المبردة مسبقا. ضع الحاوية في الثلاجة عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، قم بإزالة الأنابيب من الثلاجة وتخزينها في المرحلة الغازية من النيتروجين السائل. كان عدد الخلايا وصلاحيتها متسقين قبل وبعد الحفظ بالتبريد مما يشير إلى نجاح العزل والحفظ.
