للبدء ، اضبط معلمات محطة الماصة الموضوعة في غطاء التدفق الصفحي على 1،900 فولت ، 20 مللي ثانية في نبضة واحدة. قم بإزالة أنبوب النقل بعناية من العبوة لإبقائه معقما واملأه بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت E. لتحضير الخلايا للتثقيب الكهربائي ، قم بإزالة وسط النمو من الخلايا وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة المصل والكاتيونات ثنائية التكافؤ التي تعزز الالتصاق.
ثم أضف مزيجا من PBS و EDTA مليمولار واحد إلى الخلايا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تقريبا حتى تبدأ الخلايا في الانفصال. ماصة صعودا وهبوطا بلطف لفصل الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب منخفض البروتين ملزمة 15 ملليلتر. بيليه الخلايا في 500 غرام لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي بسرعة إزالة معظم طاف ، وترك حوالي ملليلتر واحد من طاف في الأنبوب. أعد تعليق الخلايا في المادة الطافية المتبقية وانقلها إلى أنبوب ميكروفوج منخفض البروتين سعة 1.5 ملليلتر. قم بإزالة حصة صغيرة من الخلايا لعد الخلايا المتبقية وتكسيرها عن طريق التسريب المركزي عند 500 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
عد الخلايا أثناء الطرد المركزي. خذ 1x sgRNA في محلول Cas9 20 مليمولار وقم بتسخين الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة كل المادة الطافية من حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في PBS مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم بتركيز 40 مليون خلية لكل ملليلتر.
بالنسبة لتجميع مركب البروتين النووي الريبي sgRNA Cas9 ، أضف 2.5 ميكرولتر من sgRNA إلى ميكرولتر واحد من Cas9 المخفف في أنابيب PCR معقمة وقم بتوزيع sgRNA ببطء مع الخلط لمدة 15 ثانية تقريبا لمنع هطول الأمطار. احتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح لتشكيل مجمع البروتين النووي الريبي. لتوصيل مركب البروتين النووي الريبي عن طريق التثقيب الكهربائي ، قم بإعداد طرف التثقيب الكهربائي عن طريق الضغط على المكبس لتمديد الساق.
ثم أدخل الجذع في الحافة. أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. قم بتحميل طرف التثقيب الكهربائي بالخلايا واسحب سعة الحجم الكاملة البالغة 10 ميكرولتر للطرف.
بدءا من sgRNA للتحكم السلبي ، انقل 10 ميكرولترات من الخلايا في طرف التثقيب الكهربائي إلى أنبوب العينة الذي يحتوي على 3.5 ميكرولتر من البروتين النووي الريبي. ماصة لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لخلط جيدا ، وسحب 10 ميكرولتر من الخليط مرة أخرى في الحافة. ضع الطرف في محطة التثقيب الكهربائي ، وقم بخفضه في المخزن المؤقت ، واضغط على Start على شاشة اللمس.
بعد الانتهاء ، ستشير الشاشة إلى نبض ناجح. أخرج الماصة من الجهاز وضع الخلايا في بئر جاف من لوحة البئر 12 غير المطلية. شطف الطرف عن طريق ماصة صعودا وهبوطا مرتين في 15 ملليلتر من PBS مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم.
ضع الماصة جانبا مع استمرار تثبيت الحافة. أضف على الفور ملليلتر واحد من الوسط الخالي من المضادات الحيوية المقتبسة سابقا إلى الخلايا وهز اللوحة برفق لخلطها. يظهر هنا مخطط كروماتوجرام تسلسل سانجر التمثيلي لموضع Rosa 26 من البلاعم المشتقة من نخاع العظم المكهربة باستخدام بروتين نووي ريبونوكليوبروتين sgRNA Cas9 غير مستهدف خاضع للرقابة ، و Rosa 26 sgRNA المحدد ، وجينات Src و Cblb في البلاعم المحررة.
يظهر تحليل الجينات المستهدفة بواسطة تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل سانجر نيوكليوتيدات متعددة في كل موضع في اتجاه مجرى موقع انشقاق Cas9. تؤكد هذه النتائج تحقيق كفاءة تحرير عالية للعديد من الجينات المستهدفة.
