Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

للبدء ، قم بإذابة قارورة التبريد الخاصة ب PBMC في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق مع قلبها برفق. ثم نقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. اشطف قارورة التبريد بمليلتر واحد من وسط النمو الكامل الدافئ ، وأضف المحلول بالتنقيط إلى الخلايا الموجودة في الأنبوب المخروطي لأداء خطوة التخفيف الأولى.

الآن الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة خمس دقائق وقلب الأنبوب المخروطي بطلاقة لإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو الكامل الدافئ. لعد الخلايا ، امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع تريبان الأزرق.

عد الخلايا باستخدام 10 ميكرولترات من محلول الخلايا الملطخة ، إما باستخدام عداد خلية آلي أو حجرة خلوية. استخدم وسط النمو الكامل الدافئ لتخفيف الخلايا لتحقيق تركيز نهائي قدره واحد في 10 أس ست خلايا لكل ملليلتر. ثم زرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا.

أضف 100 ميكرولتر من تخفيف الدواء مرتين إلى كل بئر. لحصاد الخلايا ، قم بطرد مركزي لوحة ثقافة الخلية لمدة 10 دقائق. استخدم مضخة تفريغ لإزالة المادة الطافية أثناء وضع طرف المضخة في الزاوية السفلية من البئر للاحتفاظ بالخلايا.

أضف الآن 200 ميكرولتر من الثلج البارد PBS إلى كل بئر. بعد الطرد المركزي للوحة لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية. ثم أضف 15 ميكرولترا من محلول التحلل إلى كل بئر.

باستخدام فيلم مانع للتسرب لاصق ، أغلق اللوحة للحماية من التلوث. دوامة اللوحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، اجمع ستة ميكرولترات من محلول الخلية المحللة في لوحة PCR.