Whole Mount Preparation and Confocal Imaging of the Murine Ocular Lens Anterior Region for Structural, Developmental, and Functional Insights

ابدأ الإجراء عن طريق إنشاء divots الشلل في agarose. للقيام بذلك ، قم بتسخين وخلط 2٪ من الأغاروز في برنامج تلفزيوني ، باستخدام ميكروويف ، حتى يتم تسييل المحلول. ماصة 250 ميكرولتر من الأغاروز المسال في طبق ذو قاع زجاجي.

وباستخدام زلة غطاء بلاستيكي مرنة ، قم بتسطيح الأغاروز عبر الطبق. بمجرد أن يبرد الأغاروز ويتصلب تماما ، استخدم ملقط رفيع الطرف لإزالة انزلاق الغطاء. ثم ، باستخدام لكمة خزعة ثلاثة ملليمترات ، قم بإنشاء ثقب في الأغاروز في وسط الطبق.

بمساعدة مسح مهمة دقيقة ، قم بإزالة الأغاروز الزائد. قم بتخزين قالب الأغاروز ، الرطب باستخدام برنامج تلفزيوني ، عند أربع درجات مئوية ، حتى الاستخدام. قبل تركيب عدسة العين الانعكاسية المعزولة ، أضف ملليلتر من الوسط المناسب إلى قالب الأغاروز المحضر ، اعتمادا على نوع العدسة.

باستخدام ملقط الجنين ، انقل العدسة الثابتة أو الحية برفق إلى divot في الأغاروز. ثم ضع الطبق على مرحلة المجهر المقلوب. تأكد من أن العدسة تقع مع المنطقة الأمامية التي تواجه الهدف ، من خلال تصور تلطيخ النوى.

إذا لم يتم ملاحظة أي نوى ، فاستخدم ملقط منحني لتدوير العدسة برفق حوالي 180 درجة ، بحيث تواجه المنطقة الأمامية الهدف. بعد ذلك ، تابع الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر. لتصور كبسولات العدسة ، احصل على صور Z-stack باستخدام هدف 40x ، بحجم خطوة يبلغ 0.3 ميكرون.

الحصول على الصورة الأولى قبل سطح كبسولة العدسة ، المشار إليها بتلطيخ WGA ، والصورة الأخيرة بعد السطح القمي للخلايا الظهارية. لتصور الخلايا الظهارية ، احصل على صور Z-stack باستخدام هدف 63x بحجم خطوة يبلغ 0.3 ميكرون.