قبل مرور الخلية. قم بتغطية صفيحة من ستة آبار بمحلول طلاء بارد واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة ، ونضح وسط الخلايا الجذعية من الصفيحة المكونة من ستة آبار والتي تحتوي على خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات ، وأضف ملليلتر واحد من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر. بعد الغسيل الثاني ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التفكك في كل بئر واحتضانه لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
في غضون ذلك ، قم باستنشاق محلول الطلاء من الصفيحة المكونة من ستة آبار وأضف ملليلتر واحد من DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر. تحت المجهر المقلوب ، راقب عملية تفكك الخلايا. عندما يبدو أن 80 إلى 90٪ من الخلايا مستديرة وملتصقة ، قم بشفط محلول التفكك من آبار الصفيحة المكونة من ستة آبار.
ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط الخلايا الجذعية الذي يحتوي على 10 مثبطات صخور ميكرومولار في الصفيحة المكونة من ستة آبار. أضف 10 ميكرولترات من معلق الخلية المنفصل في أنبوب. ثم أضف حجما متساويا من التريبان الأزرق.
تخلط بلطف وتحسب الخلايا باستخدام مقياس الدم. بعد عد الخلايا ، أضف ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية لكل بئر يحتوي على 0.8 إلى 1 مرات 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر و 10 ميكرومولار مثبط للصخور. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، جنبا إلى جنب ، ثلاث مرات.
ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر 10 مرات قبل الحضانة لمدة ساعتين. قم بإذابة كل من الوسط القاعدي لليومين صفر والرابع والمكملات الغذائية على الجليد.
قم بتسخين ملليلتر كل يوم متوسط واحد وغسل متوسط واحد في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم باستنشاق وسط الخلايا الجذعية من آبار صفيحة من ستة آبار وأضف ملليلتر من وسيط الغسيل واحد. بعد استنشاق وسط الغسيل الأول ، أضف على الفور ملليلتر من اليوم الأول المتوسط إلى جانب البئر.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم 12 من عملية التمايز ، قم بمعالجة صفيحة من ستة آبار تحتوي على آبار دقيقة 400 ميكرومتر مع ملليلتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق. تحت المجهر المقلوب ، راقب لوحة الفقاعات.
إذا لم تلاحظ أي فقاعات ، قم باستنشاق محلول الشطف المضاد للالتصاق وأضف على الفور ملليلتر من وسيط الغسيل اثنين. ثم ، نضح وسط السلف البنكرياس وإضافة 0.5 ملليلتر من العازلة التفكك لكل بئر. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.
عندما يتم تقريب معظم الخلايا ولا تزال ملتصقة ، قم باستنشاق المخزن المؤقت للتفكك وأضف على الفور ملليلتر واحد من وسط الكتلة الدافئ إلى كل بئر. باستخدام طرف ماصة P1000 ، قم بفصل الخلايا برفق ، وسحب السحب لأعلى ولأسفل أثناء استخدام حركة دائرية بالتناوب والانتقال من أعلى البئر إلى أسفله لفصل الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر. انقل خليط الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي حجمه 50 ملليلتر.
أضف ملليلترا واحدا من الوسط العنقودي إلى اللوحة المكونة من ستة آبار لجمع كل الخلايا المتبقية. بعد ذلك ، قم بنضح وسيط الغسيل الثاني من لوحة microwell المكونة من ستة آبار وإضافة تعليق خلية منفصل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، باستخدام طرف ماصة P1000 ، اجمع ببطء مجموعات من لوحة microwell المكونة من ستة آبار في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أضف ملليلتر واحد من وسط اليوم 13 لجمع المجموعات المتبقية ونقل المجموعات إلى الأنبوب. اسمح للخلايا بضبط الجاذبية بشكل طبيعي في قاع الأنبوب لمدة خمس دقائق.
استنشاق بعناية طاف من الأنبوب دون إزعاج مجموعات الخلايا. ثم أضف ملليلتر من وسط اليوم 13 في الأنبوب. امزج بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، وتجنب شفط المجموعات.
انقل التعليق إلى لوحة ذات ستة آبار منخفضة الالتصاق. حرك اللوحة بسرعة ذهابا وإيابا ، من جانب إلى آخر ، ست مرات. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
أظهرت صور التألق المناعي للمجموعات غلبة الخلايا المنتجة للأنسولين التي تعبر بشكل مشترك عن علامات خلايا بيتا البنكرياس. كشف التعبير عن جينات توقيع خلايا بيتا ما يقرب من 25٪ من الخلايا التي تعبر عن Nkx6.1 و 40٪ تعبر عن Pdx1. أثناء فحص إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز ، أفرزت المجموعات المشتقة من MEL1 مستويات أعلى بكثير من الأنسولين استجابة لتركيزات الجلوكوز العالية مقارنة بتركيزات الجلوكوز المنخفضة.
