للبدء ، خذ أقسام دماغ البارافين من حقن PFF C57 الفئران السوداء الستة. قم بإزالة الشمع من الشرائح عن طريق غمسها في بديل الزيلين واحتضانها لمدة دقيقتين. للإماهة ، اغمس الشرائح في 100٪ 95٪ و 70٪ إيثانول ، ثم مرتين في ماء منزوع الأيونات.
انقل العينات إلى حاوية قابلة للميكروويف مع الماء المقطر المزدوج. قم بتسخين المخزن المؤقت سترات 100 مرة مع درجة الحموضة ستة عند أربع درجات مئوية. ثم تحضير 350 ملليلتر من العازلة سترات الطازجة.
صب المخزن المؤقت سيترات المعدة في وعاء بلاستيكي مع غطاء. ضع الشرائح في حاوية العازلة للسيترات وقم بتأمين الغطاء. ضع العينات في الميكروويف عند 700 واط لمدة أربع دقائق ، ثم اترك وقتا للراحة لمدة خمس دقائق.
الميكروويف لمدة 1.5 دقيقة أخرى ، تليها فترة راحة لمدة خمس دقائق وتجديد المخزن المؤقت سيترات. ضع الميكروويف لمدة 1.5 دقيقة واتركه يرتاح لمدة خمس دقائق. ثم قم بتبريد العينات ومخزن سترات على الثلج لمدة 20 دقيقة واغسلها بالماء المقطر المزدوج.
جفف شرائح العينة باستخدام منشفة ورقية دون لمس المنديل. باستخدام قلم عنق الرحم ، ارسم مستطيلات حول قطع الأنسجة. الآن نقل جميع الشرائح إلى مربع تلطيخ المناعة الشرائح.
اغسلها برفق عدة مرات باستخدام TBS-T لضمان بقاء قطرات TBS-T داخل مستطيلات قلم PAP. اضغط على الشرائح الموجودة على منشفة ورقية لإزالة TBS-T. أضف 50 ميكرولترا من الحجب إلى كل مستطيل واحتضانه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، باستخدام منشفة ورقية ، قم بإزالة محلول الحجب من العينات. ماصة بلطف 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية و TBS-T إلى كل مستطيل واحتضان العينات بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الشرائح باستخدام TBS-T.
قم بإزالة TBS-T من خلال النقر على منشفة ورقية. كرر هذه العملية ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من خليط الأجسام المضادة الثانوي عند تخفيف واحد إلى 1000 في TBS-T لكل مستطيل واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام.
بعد ذلك ، اغسل العينة ثلاث مرات باستخدام TBS-T. ثم احتضان العينة باستخدام DAPI بتركيز 2 ميكروغرام لكل مليلتر في TBS-T لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة محلول DAPI عن طريق النقر على منشفة ورقية واغسلها ثلاث مرات باستخدام TBS-T.
لتركيب زلة غطاء زجاجي ، أضف قطرتين لكل شريحة من كاشف التركيب إلى العينات. اضغط على انزلاق الغطاء برفق للتخلص من الفقاعات واترك العينات تجف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتصوير ما لا يقل عن 50 خلية في مختلف المجالات باستخدام نظام تصوير مضان إضاءة منظم مزود بتقنية هدف زيتي أو متحد البؤر 60 مرة.
لتحليل الخلايا ، اعزل المنطقة ذات الاهتمام عن طريق رسم محيط حول الخلية الموجبة أو السالبة واستخدام وظيفة الاقتصاص. بعد ذلك ، قم بتنشيط واصفات الأشكال والحد من خيارات العتبة في وظيفة القياس المحددة. اضبط مستوى العتبة عن طريق تحديد وظيفة العتبة في قائمة الضبط.
أخيرا ، استخدم أداة تحليل الجسيمات وقم بتعيين حجم مناسب لالتقاط الميتوكوندريا. على سبيل المثال ، اضبط الحجم على 25 إلى ما لا نهاية ثم قم بتنشيط وحدات البكسل وحدد إظهار الأقنعة "يتم عرض بارس باراس كومباكتا كبير من الفئران المحقونة ب PFF الأمينية الملطخة بالتيروزين هيدروكسيلاز VDAC1 و PS129 alpha-synuclein و DAPI. سمح تلطيخ ألفا سينوكلين المضاد ل PS129 بتمييز الخلايا التي تؤوي آفات PS129 عن الخلايا السليمة.
كشف تحليل الصور لتلطيخ VDAC1 للخلايا العصبية الإيجابية لهيدروكسيلاز التيروزين عن انخفاض كل من عدد الميتوكوندريا ونسبة العرض إلى الارتفاع بين الخلايا العصبية التي تحمل آفات PS129 والخلايا العصبية التي تفتقر إليها.
