للبدء ، حدد لوحة 24 بئرا تحتوي على إدخالات مع مرشحات 0.4 ميكرون. باستخدام ماصة ، أضف 500 ميكرولتر من HBSS أسفل وفوق إدخالات المرشح. ثم أغلق اللوحة متعددة الآبار وضعها في حاضنة لمدة ساعتين.
بعد الحضانة ، استنشق بعناية HBSS من اللوحة. تحضير محلول الكولاجين الخالي من الخلايا في أنبوب معقم 50 ملليلتر في DMEM على الجليد. أضف 250 ميكرولترا من الكولاجين فوق مرشح الغشاء وضع الغطاء على اللوحة.
اسمح للمحلول بالبلمرة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة ثقافة الخلايا الليفية L-929 من الحاضنة. أضف ملليلتر من محلول التربسين EDTA المسخن مسبقا إلى القارورة وضعه في حاضنة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 645 G لمدة خمس دقائق. باستخدام مضخة تفريغ ، قم بنضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من DMEM. أضف 20 ميكرولترا من معلق الخلية إلى أنبوب يحتوي على 20 ميكرولترا من محلول Trypan Blue.
واستخدم غرفة عد الخلايا لتقييم كثافة الخلية. بعد ذلك ، قم بإزالة ثقافة الخلايا الوحيدة U-937 من الحاضنة. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من RPMI.
بعد التأكد من تعليق الخلايا بشكل متجانس ، قم بحسابها باستخدام غرفة عد الخلايا. بعد ذلك ، قم بإعداد معلقات الخلايا التي تحتوي على 50،000 خلية L-929 و 15،000 خلية U-937 على التوالي في 50 ميكرولتر من DMEM. أضف كل معلق خلية سعة 50 ميكرولتر إلى 450 ميكرولتر من الكولاجين واخلطه جيدا.
قم بتراكب الصفيحة المخصوصة الخالية من الخلايا المشفرة مسبقا مع 500 ميكرولتر من محلول خلايا الكولاجين. أغلق اللوحة وضعها في حاضنة لمدة ساعتين للسماح للحل بالضبط. بعد ذلك ، قم بإزالة ثقافة خلية Caco-2 من الحاضنة.
باستخدام مضخة تفريغ ، نضح الوسط وشطف الخلايا مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف خمسة ملليلتر من محلول PBS trypsin EDTA وضعه في حاضنة لمدة خمس إلى ثماني دقائق. ثم أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من DMEM.
بعد العد ، قم بإعداد تعليق خلية يحتوي على 150،000 خلية Caco-2 في 50 ميكرولتر من DMEM. ضع اللوحة في غطاء تدفق رقائقي لمدة 10 دقائق قبل نقلها إلى الحاضنة. بعد 30 دقيقة ، أضف 500 ميكرولتر من DMEM فوق النموذج المعاد بناؤه و 500 ميكرولتر أسفل المرشح وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
في اليوم التالي ، استبدل الوسط بعناية ب 500 ميكرولتر من DMEM الطازج أعلى وأسفل المرشح على التوالي.
