للبدء ، يحول الخط زراعة خلايا Agrobacterium tumefaciens إلى ألواح Yeast Mannitol Agar التكميلية بالمضادات الحيوية الانتقائية. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في حاضنة دائمة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح المستعمرات من الثقافة على 12.5 ملليلتر من مزيج مرق الخميرة مانيتول لوريا بيرتاني ، واحتضانها على شاكر مداري عند 28 درجة مئوية لمدة 16 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة.
تلقيح 12.5 ملليلتر من سلالة Agrobacterium LBA4404 في 112.5 ملليلتر من مرق الخميرة مانيتول بالمضادات الحيوية. احتضان الثقافة على شاكر مداري عند 28 درجة مئوية لمدة 16 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة. اضبط الثقافة الليلية على كثافة بصرية تبلغ 0.4 باستخدام مرق الثقافة.
ثم أضف 20 ميكرومولار من الأسيتوسيرينغون قبل الحضانة. بمجرد أن تصل الثقافة المحتضنة إلى كثافة بصرية واحدة ، أجهزة طرد مركزي لتكوير الخلايا. أعد تعليق الحبيبات في محلول معلق إلى كثافة بصرية تبلغ 0.6 ، وأضف 200 ميكرومولار أسيتوسيرينجون قبل الحضانة.
للتسلل الزراعي ، اختر نباتات الكاكاو الخشبية التي لها فروع بأوراق. أضف 250 ميكرومولار حمض الياسمونيك إلى تعليق Agrobacterium. بعد ذلك ، قم بإعداد مجفف بمقياس فراغ كغرفة تفريغ لقياس الضغط بالداخل.
ضع حلقة قفز للسماح لفرع النبات بالمرور. ضع الدورق مع مزرعة Agrobacterium داخل المجفف ، وضع الفرع بين المجفف وغطاءه ، مع غمر الأوراق المرغوبة في مزرعة Agrobacterium. بعد ذلك ، استخدم مادة انطباع السيليكون لسد الفجوات بين حلقة القفز وفرع النبات والمجفف.
بمجرد بلمرة مادة السيليكون ، أغلق المجفف ، دون ترك فجوات ، ثم قم بتوصيله بمضخة التفريغ. ابدأ تشغيل مضخة التفريغ حتى تصل إلى ناقص 0.07 ميجاباسكال. عند الوصول إلى الضغط المطلوب ، أغلق صمام الضغط وأوقف تشغيل المضخة للحفاظ على الضغط لمدة خمس دقائق.
افتح صمام الضغط تدريجيا وبثبات لاستعادة ضغط الغرفة. بعد تكرار التسلل مرتين أخريين ، أخرج الفرع من تعليق الخلية. نظف الأوراق المتسللة بالماء المقطر ، ثم ضع النباتات على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 48 ساعة.
بعد الحضانة ، قم بتعريض الأنسجة المخترقة لضوء لمدة 16 ساعة وفترة تصوير مظلمة لمدة ثماني ساعات. تبدو الأوراق المتسللة للنباتات أغمق في أجزاء معينة ، مما يدل على تغلغل Agrobacterium. أنتج نظام المراسل المستخدم تراكم البيتالين على الأوراق ، والذي يمكن ملاحظته بسهولة على أنه تصبغ أحمر فاتح بالعين المجردة.
لوحظ أن تراكم بيتالين يختلف مع صلاحية الأنسجة.
