ابدأ بإعادة تعليق الببتيد MOG 35 55 المجفف بالتجميد في الماء. تمييع مخزون الببتيد إلى 10 ميكروغرام لكل ملليلتر في عازلة الطلاء قبل التجربة. الآن ماصة 100 ميكرولتر من الحل النهائي في آبار 96 لوحة بئر.
قم بتغطية عدد متساو من الآبار في وقت واحد ب 100 ميكرولتر من BSA المذاب في محلول الطلاء. أغلق اللوحة بغشاء لاصق لمنع التبخر واحتضان اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإجراء ثلاث غسلات من اللوحة مع 200 ميكرولتر من PBS مكملة بنسبة 0.5٪ توين 20.
أضف بعد ذلك 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول مانع يتكون من 3٪ BSA في PBS. احتضان اللوحة المختومة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن التهجين. بعد الحضانة ، اغسل اللوحة ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر لكل بئر من PBST.
قم بتخفيف كل عينة مصل تم الحصول عليها من دم الفئران المحصنة EAE في محلول مانع وإضافة 100 ميكرولتر لكل بئر إلى كل من الآبار المطلية ب MOG 35 55 و BSA. أضف نفس الحجم من محلول الحجب إلى الآبار الفارغة المعينة. احتضان لوحة مختومة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر.
بعد الحضانة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وشطف اللوحة ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر لكل بئر من PBST. تمييع الجسم المضاد الثانوي المترافق HRP في محلول يتكون من 0.2٪ BSA في PBST وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان اللوحة المختومة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الحفاظ على الاهتزاز المستمر.
اغسل الطبق ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر لكل بئر من PBST. أضف 100 ميكرولتر من ثلاثة ، ثلاثة أولية ، خمسة ، خمسة ركيزة رباعي ميثيل البنزيدين الأولية إلى كل بئر. احتضان في الظلام لمدة دقيقة إلى خمس دقائق مراقبة تطور اللون الأزرق.
أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف لكل بئر. ثم استخدم قارئ لوحة مضبوطا بطول موجي يبلغ 450 نانومتر لقياس الكثافة البصرية في كل بئر. كانت قيم الكثافة البصرية لعينات EAE أعلى بكثير من عينات التحكم التي تشير إلى استجابة قوية للغلوبولين المناعي G ضد ببتيد MOG.
