للبدء ، قم بتعقيم وتشريح العيون المنزوعة النواة التي تم الحصول عليها من متجر جزارة تم تفتيشه من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، لإعداد كوب العين. ضع كوب العين برفق ، مع توجيه الجزء الداخلي لأعلى ، في طبق بتري الذي يحتوي على مصفاة الخلية. أضف DPBS المبرد إلى كوب العين ، مما يضمن أن مستوى السائل أقل بقليل من أدنى نقطة في الشق.
تحت مصباح يدوي ، ابحث عن أي مناطق تبدأ فيها الشبكية العصبية في الانفصال عن ظهارة الشبكية الصبغية ، ثم استخدم ملاقط حادة للإمساك برفق على الشبكية العصبية المرفوعة وتقشيرها بعيدا. اجمع الشبكية العصبية برفق بالقرب من القرص البصري. باستخدام ماصة المراعي المتصلة بنظام شفط الفراغ ، قم بشفط شبكية العين العصبية.
أضف DPBS مبردا إضافيا بعناية لاستبدال الحجم المستنشق. الآن ، استنشق هذا DPBS المضاف لإزالة أي شبكية عصبية متبقية. بعد إزالة الشبكية العصبية من جميع أكواب العين ، أضف التربسين برفق إلى كل كوب عين واستبدل غطاء طبق بتري.
احتضان العينين مع التربسين عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. تحت مصباح يدوي ، استخدم ألف ميكرولتر ماصة لإزاحة خلايا ظهارة الشبكية الصبغية بلطف من كل كوب عين. نقل الخلايا التي تم إزاحتها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
اغسل كوب العين بوسائط زراعة الخلايا لجمع أي خلايا متبقية وكذلك لتحييد التربسين. امزج هذه الخلايا التي تحتوي على الوسائط مع الخلايا التي تم جمعها مسبقا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية في 250G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم, قم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل بيليه الخلية. أعد تعليق كل حبيبة خلية في ثلاثة ملليلتر من محلول عمل D anase. احتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة.
ثم ، أجهزة الطرد المركزي في 150G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة ملليلتر من وسائط زراعة الخلايا الطازجة. نقل الخلايا التي تم الحصول عليها من عينين إلى ثلاث عيون في بئر واحد من صفيحة ستة آبار واعتبر هذا بمثابة ممر صفر.
بعد ذلك ، انقل بعناية صفيحة الآبار الستة المصنفة إلى حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم عزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية الأولية من عيون الخنازير مع تصبغ مميز واضح بعد ثلاثة أيام من العزل. حققت الخلايا التقاء كامل بعد أسبوع واحد ، مما يدل على وجود طبقة أحادية صحية.
تم التعرف على الثقافات التي تظهر مورفولوجيا غير طبيعية وتصبغ مفرط على أنها ملوثة ولم تستخدم في التجارب.
