للبدء ، تأكد من إعداد تخطيط المجهر على سطح الطاولة البصرية مع قياس جميع المسافات بدقة. ثم قم بتركيب ليزر الإثارة على الطاولة. اضبط قزحيتين على الارتفاع المقصود لليزر ، واستخدم هذه القزحية للتأكد من أن الحزمة مستوية ومركزة.
ضع مرحلة الترجمة ، أو TS1 ، تحت موقع المرآة 1 ، أو M1. استخدم زوج القزحية المضبوط على الارتفاع الدقيق لتحديد مسار شعاع الخروج المطلوب وتوجيه موضع ومحاذاة كل عنصر عاكس. بعد ذلك ، ضع M1 في الجزء العلوي من TS1. ثم قم بتركيب ومحاذاة ثنائي اللون فوق الطاولة.
وبالمثل ، قم بتركيب galvo ومواءمته مع القزحية. بمجرد إجراء المحاذاة ، ضع M2 ثم ثبت M3 على الطاولة. اضبط الارتفاع والموضع حتى يتم توسيط الحزمة تقريبا على كل من أقراص محاذاة الزجاج المصنفر.
أضف دعامات إلى M3 بعد ذلك. بعد ذلك ، ابدأ في تركيب العدسة 1 على الطاولة. اضبط الإمالة والموضع الجانبي حتى يتم توسيط الشعاع على الألواح الزجاجية المصنفرة فوق M3. ضع العدسة 2 وتحقق من الموازاة باستخدام مرآة لترتد الحزمة على سطح بعيد.
استخدم بطاقة فهرسة أو هدفا لتتبع الحزمة وتأكد من أن الحزمة لا تتغير في الحجم. ثم اضبط موضع x ، y للثقب باستخدام حامل XY والمسافة المحورية مع المرحلة أحادية البعد لزيادة ناقل الحركة. اضبط العدسة 4 محوريا لتركيز شعاع الإثارة على سطح galvo وترتيب العدسة 3 على الطاولة ، متبوعا ب SL1.
اضبط المسافة المحورية ل SL1 لتشكيل تلسكوب مع عدسة 4 ، ثم ضع TL1 بالتوازي مع SL1. اضبط ارتفاع الهدف 1 على نظام القفص حتى تشكل الحزمة قرصا متجدد الهواء على السقف. ثم استمر في الضبط حتى يتم تصغير حجم القرص.
ضع المرآة المربعة على مرحلة عينة الهدف 1 واضبط المرآة محوريا حتى يتم تقليل حجم ملف تعريف الحزمة بعد ثنائي اللون. قم بتركيب ليزر المحاذاة عن طريق تحريك قضبان القفص في الثقوب الفارغة للوحين القفصيين. استخدم حامل مرآة حركيا واحدا ومرآة منسدلة واحدة لمحاذاة مسارات حزم المحاذاة والإثارة.
ضع المرآة المربعة محوريا على مرحلة العينة للهدف 1 لتقليل ملف تعريف الحزمة بعد ثنائي اللون. أدخل SL2 و TL2 في مسار الانبعاث على المسافات المعنية. اضبط مقابض XY وإمالة الهدف 2 بحيث يمر شعاع المحاذاة الأحمر عبر القزحية والقرص الزجاجي المصنفر.
اضبط مرحلة الترجمة 2 حتى تشكل الحزمة قرصا صغيرا جيد التهوية على السطح ، ثم استمر في ضبط مرحلة الترجمة 2 لتقليل حجم القرص جيد التهوية. لتحسين galvo للإمالة في المسح المتغير ، اضغط على زر FSK في مولد الشكل الموجي لتحديد إشارة موجة مثلثة ل galvo وضبطها على تردد منخفض ، مثل 1 هرتز. راقب شعاع المحاذاة على نفس السطح أو الجدار البعيد.
قم بتركيب الهدف 3 حوالي 4-5 ملليمترات أمام الهدف 2 بزاوية 0 درجة واضبط الارتفاع لمطابقته. ضع قرص محاذاة زجاجي بلوري في المستوى البؤري المشترك بين SL2 وTL2 كما تم قياسه باستخدام مسطرة. بمجرد أن يملأ ضوء الانبعاث الفتحة الخلفية ل O3 ، قم بتركيب قرص زجاجي بلوري في الموضع التقريبي لمستشعر الكاميرا وقم بمحاذاة مركز القرص مع ضوء الانبعاث الخارج من O3. ضع TL3 خلف الهدف 3 واضبط الإمالة لمحاذاة الضوء الصادر مع القرص الزجاجي المصنفر.
ضع الكاميرا على مسافة مقاسة من عدسة الأنبوب واضبط الهدف 3 محوريا من مرحلة ترجمة القفص حتى يتم التركيز على الفتحة على الكاميرا. أعد ضبط الهدف 3 بزاوية 30 درجة من المحور الأصلي للهدف 2 باستخدام الخطوط الموجودة على الطاولة كدليل. أعد تركيب هدف اختبار الشبكة الإيجابي على نفس الارتفاع المحوري وأضيء الشبكة بضوء المجال الساطع.
قم بمسح جزء التركيز البؤري من مجال الرؤية عبر الشاشة أفقيا بينما تحافظ مربعات الشبكة على حجم موحد. لمحاذاة ورقة الضوء المائلة ، ضع العدسات الأسطوانية ، أو CL ، بحيث يتم تركيز الحزمة في ملف تعريف أفقي للورقة عند المستوى البؤري ل CL3. أدخل شقا وضعه في الاتجاه الرأسي عند المستوى البؤري بين CL3 والعدسة 3.
في مستشعر الكاميرا ، تأكد من أن ورقة الضوء 0 درجة تبدو رفيعة ورأسية. باستخدام التحكم في مرحلة الترجمة الآلية ، قم بترجمة M1 نحو العدسات الأسطوانية لزاوية ورقة الضوء. أدخل عينة اختبار الأنابيب الدقيقة التي تحمل علامة الرودامين المعدة مسبقا في مرحلة العينة واضبطها محوريا بحيث تضيء الصبغة بواسطة ورقة الضوء على خمسة أعماق مختلفة بين مركز مجال الرؤية والجانب الأيمن من الشاشة.
ثم احفظ كل صورة. افتح الصور في فيجي. لكل صورة، باستخدام أداة الخط ارسم خطا أفقيا من مركز مجال الرؤية إلى مركز ورقة الضوء.
ثم انتقل إلى تحليل ، متبوعا بملف تعريف المؤامرة لحساب زاوية ورقة الضوء أعلاه 01. بعد معايرة الجهاز ، قم بتركيب عينة الخرزة ثلاثية الأبعاد المعدة مسبقا وانقر فوق زر FSK على مولد الوظائف لتعيين موجة مثلث. للعثور على العينة ، استخدم مولد الوظائف لتعيين المعلمات بدءا من تردد 20 ميجاهرتز ، و 400 مللي فولت من الذروة إلى سعة الذروة و 0.4 إزاحة.
قم بالتمرير في Z يدويا حتى يتم الوصول إلى مستوى العينة وقم بتحسين إعداد Z. في برنامج micromanager ، حدد وقت التعرض وافتح نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد. اضبط الفاصل الزمني على 30 واستخدم مربع العد لاختيار عدد الإطارات.
بمجرد تعيين المعلمات ، سجل الفاصل الزمني لمسح كامل واحد لوحدة التخزين. أظهرت عمليات المسح الحجمي لشبكة الأنابيب الدقيقة المعاد تشكيلها أن الهياكل ثلاثية الأبعاد نمت كثيفة نحو المركز ، مما أدى إلى مناطق مشرقة من التألق. في طائرات التصوير بالقرب من انزلاق الغطاء ، قام الفحص المجهري متحد البؤر بحل خيوط مفردة حول محيط Astar مع خلفية إضافية نحو المركز بسبب إشارات الفلورسنت خارج التركيز من الأعلى.
ومع ذلك ، فإن تحريك بضعة ميكرونات في Z قلل بسرعة من جودة الصور بسبب الأقسام الكثيفة خارج التركيز في Astar. أدت إضاءة المستوى الواحد لورقة الضوء إلى التخلص من الإشارات خارج نطاق التركيز ، مما يسمح بجودة صورة مماثلة بين المستويات.
