للبدء ، أعد تعليق الببتيد المركب الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابي بتركيز 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر في DMSO. امزج الببتيد المعاد تعليقه مع ببتيد هيستون H4 البيوتينيل لإنشاء منحنى قياسي. بعد ذلك ، قم بتجميع تفاعلات الأستيل في نسختين في 96 لوحة PCR جيدة.
يجب أن يشتمل التفاعل الذي مقداره 20 ميكرولترا على 10 ميكرولترات من الإنزيم، وميكرولتر واحد من الببتيد H4، وميكرولتر واحد من المخزن المؤقت 20X، وميكرولتر واحد من DTT. أضف ميكرولترا واحدا من DMSO أو مركب الاختبار في كل بئر. ماصة بلطف الخليط لخلط.
ثم احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقائق للسماح لتعقيد مثبطات الإنزيم. لاستمرار تفاعل الأستيل ، اجمع بين ميكرولتر من الإنزيم المساعد لزيت 4-Penten A مع أربعة ميكرولترات من الماء. أضف ستة ميكرولتر من هذا الخليط إلى الآبار.
بعد الخلط اللطيف ، قم بطرد الخليط عند 300 جرام لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. احتضان المحتويات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في أنابيب مغطاة. قم بإخماد المحتويات ب 20 ميكرولترا من اليوريا ذات الثمانية مولات وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تتم المعالجة الإضافية.
بعد ذلك ، ماصة 80 ميكرولتر من PBST في كل بئر من ألواح 96 بئرا السوداء المطلية مسبقا ب BSA NeutrAvidin. أضف 40 ميكرولترا من محتويات التفاعل إلى آبار اللوحة. ثم ماصة الببتيدات منحنى القياسية في نسختين في الآبار المتبقية.
حرك الببتيدات برفق على شاكر مداري لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل الربط. بمجرد اكتمال الربط ، قم باستنشاق السائل من الآبار. استخدم غسالة الأطباق لغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBST.
لتفاعل النقر ، أضف خليط النحاس THPTA إلى أسكوربات الصوديوم في الماء وأزيد البيوتين في DMSO. قم بتوزيع 19 ميكرولتر من الكواشف المخلوطة حديثا في كل بئر. ختم اللوحة بورق الألمنيوم.
ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. نضح الحل من الآبار قبل الغسيل كما كان من قبل. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من مزيج بيروكسيديز الفجل الستربتافيدين المخفف في كل بئر.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف على شاكر المداري. للجمع بين كواشف الكشف Amplex Red ، ماصة 500 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين المخفف إلى كاشف Amplex Red. أضف 50 ميكرولترا من هذا الخليط إلى 4.5 ملليلتر من فوسفات الصوديوم.
ماصة 100 ميكرولتر من خليط تفاعل Amplex Red إلى الآبار المغسولة. ثم احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة بعيدا عن الضوء. قم بتشغيل برنامج SmartControl وانقر فوق Plate Out.
بمجرد نقل اللوحة إلى الجهاز ، انقر فوق رمز Amplex Red وقم بتغيير تخطيط اللوحة. اضغط على أيقونة Amplex Red مرة أخرى لرؤية التخطيط الذي تم تغييره. ثم حدد الآبار القياسية العلوية اليسرى من التخطيط.
قم بتغيير اسم الملف، ثم اضغط على بدء الضبط. بمجرد تعيين الكسب ، انقر فوق بدء القياس. اضغط على الحالة الحالية لمراقبة القياس في الوقت الفعلي.
بمجرد انتهاء القياس ، أغلق علامة التبويب. ثم انقر فوق فتح آخر تشغيل في اللوحة العلوية. انتقل إلى علامة التبويب المريخ.
ثم اضغط على تصدير إلى Excel من القائمة الرئيسية لتصدير نتائج البيانات. لوحظ أن المركبات A و C تمنع نشاط HAT1 بنسبة 100٪ تقريبا للعديد من التخفيفات.
