ابدأ بتنزيل الخرائط النصفية غير الواضحة ل apo-enolase من بيانات إضافية في EMDB. ثم افتح ChimeraX وانقر على فتح في شريط الأدوات. حدد أنصاف خرائط apo-enolase.
اكتب هذا في سطر الأوامر لدمج نصف الخرائط والحصول على خريطة apo-enolase غير الواضحة. اضبط عتبة الخريطة على 0.0595 لتقليل الضوضاء. ثم اكتب هذا الأمر لإعادة تسمية الخريطة المدمجة.
انقر فوق فتح. حدد خرائط PEP enolase غير الحادة واكتب هذا الأمر في سطر الأوامر. اضبط عتبة الخريطة على 0.0721 لتقليل الضوضاء وإعادة تسمية الخريطة.
ثم اعرض خرائط apo-enolase و PEP enolase غير الحادة وانقر فوق Fit في لوحة الخريطة لحساب خريطة الاختلاف. اكتب هذا الأمر في سطر الأوامر لطرح خريطة PEP enolase من خريطة apo-enolase وضبط العتبة. قم بتلوين الخريطة المطروحة باللون الأخضر ، مما يدل على الكثافة الموجبة.
بعد ذلك ، افتح PDB وقم بتنزيل إحداثيات المتفطرة السلية أوكتامريك إنولاز. ثم في ChimeraX ، انقر فوق فتح من شريط الأدوات وحدد اسم الملف. انقر فوق عرض الجزيء وإخفاء الذرات وإظهار الرسوم المتحركة.
اكتب هذا الأمر لإعادة تسمية النموذج. حدد النموذج من لوحة النموذج. انقر على الماوس الأيمن من شريط الأدوات.
ثم انقر فوق نقل النموذج وضع النموذج بالقرب من خريطة PEP enolase. قم بمحاذاة النموذج فيما يتعلق بالخريطة. قم بتركيب هذا النموذج في خريطة PEP enolase غير الحادة عن طريق كتابة هذا الأمر في سطر الأوامر.
تحقق من الملاءمة. اضبط تمثيل اللون والهيكل. افتح Coot من المحطة عن طريق كتابة coot& انقر فوق ملف، ثم افتح الإحداثيات، وحدد Apo-enolase.pdb.
بعد ذلك ، قم بتنزيل خريطة شحذ enolase المرتبطة ب PEP من EMDB. اعرض هذه الخريطة في Coot بالنقر فوق ملف وفتح الخريطة. قم بتمرير زر الماوس الأوسط لتعيين الحد إلى 7.00 سيجما.
انقر فوق التحقق من الصحة ، ثم النقط غير النموذجية. في النافذة الجديدة ، اكتب 7.00 ك RMSD وانقر فوق البحث عن النقط. حدد كثافة الليجند غير المنمذجة بالقرب من بقايا الموقع النشط ، سيرين 42 ، ليسين 386 ، وأرجينين 364.
بعد ذلك ، انقر فوق ملف ، والحصول على مونومر ، وأدخل PEP للحصول على ملف نموذج PEP Monomer من مكتبة Coot Monomer. انقل جزيء PEP إلى الكثافة باستخدام خيار تدوير جزيء سلسلة منطقة الترجمة في قائمة الشريط الجانبي. ثم انقر فوق Real Space Refined Zone في قائمة الشريط الجانبي لتناسب جزيء PEP في الكثافة.
قم بتقييم الملاءمة وانقر على قبول عند الانتهاء. استخدم خيار دمج الجزيء في علامة التبويب تحرير لدمج الليجند المجهز مع نموذج apo-enolase وحفظ النموذج ك PEP enolase.pdb. ثم انقر فوق حساب ، أدوات NCS ، متبوعا ب NCS Ligands لإضافة روابط إلى بقية المونومرات في ملف الإحداثيات.
بالنسبة للبروتين مع خيار NCS ، حدد ملف الإحداثيات apo-enolase. pdb ومعرف السلسلة A كسلسلة رئيسية NCS. بعد ذلك ، بالنسبة للجزيء الذي يحتوي على ligand ، حدد apo-enolase.
pdb كملف الإحداثيات ومعرف السلسلة J ورقم البقايا 121. انقر فوق البحث عن وظائف المرشحين. انقر على الروابط المرشحة الفردية وقم بتحليل الملاءمة بصريا.
ثم قم بنمذجة أيونين مغنيسيوم في كثافة الموقع النشط بالنقر فوق وضع الذرة عند المؤشر وتحديد MG من قائمة نوع ذرة المؤشر. أضف أيضا أيونات المغنيسيوم في المونومرات المرتبطة بالتماثل. تقييم مدى ملاءمة ذرات المغنيسيوم المرتبطة بالتماثل.
احفظ النموذج بالنقر فوق ملف ، ثم حفظ الإحداثيات. حدد اسم الملف وكتابة enolase بالإضافة إلى PEP بالإضافة إلى MG.pdb. ثم افتح واجهة المستخدم الرسومية فينيكس.
قم بتشغيل مهمة تحسين مساحة حقيقية باستخدام المعلمات الافتراضية مع النموذج المحفوظ والخريطة الحادة المرتبطة ب PEP. لتصور الرباط المصمم ، افتح PyMOL ، وانقر فوق ملف ، وفتح لتحميل النموذج المكرر من مهمة تحسين Phoenix. قم أيضا بتحميل خريطة شحذ PEP المرتبطة.
أعد تسمية الخريطة حيث تم شحذ PEP بالنقر فوق الإجراءات ثم إعادة التسمية. ثم حدد الروابط بالنقر فوق عرض متبوعا بالتسلسل. اكتب هذا في سطر الأوامر واضغط على Enter.
يؤدي هذا إلى نحت كثافة الخريطة حول التحديد. انقر فوق المربع الأخير ، C ، بجوار الكائن mesh_ligand لتغيير لون شبكة ligand إلى اللون الأزرق. عرض بقايا الموقع النشط التي تتفاعل مع PEP وأيونات المغنيسيوم في تمثيل العصا والكرة وإنزيم enolase في تمثيل الرسوم المتحركة.
ضبط حجم الشبكة. اكتب هذا في سطر الأوامر لإجراء تتبع الأشعة وحفظ الصورة كملف PNG. أثناء تحلل الجلوكوز ، يحول enolase اثنين من الفوسفوغليسيرات إلى فسفوينول بيروفات ، وهو وسيط حيوي لمختلف المسارات الأيضية.
أظهرت خريطة الفرق بين إنزيم apo والإنزيم المرتبط ب PEP كثافة ليجند مميزة. أيضا ، لوحظت كثافة إضافية في الموقع النشط للبروتين النموذجي. تم نمذجة فوسفونول بيروفات واثنين من أيون المغنيسيوم في الكثافة التي لوحظت بالقرب من الرباط.
شكل فوسفينول بيروفات روابط هيدروجينية مع العديد من بقايا الموقع النشط ، مثل ليسين 386 وأرجينين 364. شكلت أيونات المغنيسيوم روابط تنسيق فلزية مع الأسبارتات 241 والغلوتامات 283 والأسبارتات 310 وفوسفات فوسفوينول بيروفات.
