للبدء ، خذ مزارع لمدة 12 يوما من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات التي تعرضت لتحريض القمة العصبية. نضح بلطف المتوسطة C من الخلايا. أضف 100 ميكرولتر من PBS لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح البئر لغسل الخلايا ، ثم قم بإزالة PBS.
أضف حجما متساويا من محلول انفصال الخلايا إلى الخلايا واحتضانها لمدة 30 دقيقة تحت مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. أضف حجما متساويا من وسط NCC إلى اللوحة. بعد ذلك ، استخدم ماصة مصلية لحصاد تعليق الخلية ونقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.
قم بتدوير الخلايا عند 290 جراما لمدة دقيقتين بين 20 إلى 25 درجة مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لماصة 12 ملليلتر من وسط NCC إلى حبيبات الخلية.
ماصة ميكانيكيا التعليق صعودا وهبوطا لإنشاء تعليق. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية. في اليوم 14 ، قم بتدوير ألواح زراعة الخلايا برفق لجمع كرويات صغيرة في وسط كل بئر.
استخدم ماصة صغيرة P1000 لشفط الوسط المستهلك ببطء من محيط كل بئر. أعد تغذية الخلايا بالحجم الأصلي لوسط NCC. في اليوم 15 ، قم بإزالة الوسيط بعناية.
أضف برنامج تلفزيوني إلى الآبار لغسل الأجسام الكروية. بعد ذلك ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS ، مع ضمان عدم إزعاج الأجسام الكروية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح البئر.
احتضان الخلايا في المحلول لمدة 30 دقيقة تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر ، أضف حجما متساويا من وسط ENC إلى كل بئر. ماصة ميكانيكيا الحل لكسر أي كرويات متبقية.
ثم نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي كما كان من قبل. ثم أعد تعليق الخلايا في 5 إلى 10 ملليلتر من وسط ENC.
عد تركيز الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق ومقياس الدم. الآن ، أضف حجما كافيا من وسط ENC إلى اللوحة حوالي 300،000 إلى 400،000 خلية قابلة للحياة لكل سنتيمتر مربع من مساحة السطح ، وكثافة حوالي 1 مليون خلية لكل ملليلتر. ثم ، نضح الحلول من الآبار.
بعد ذلك ، أضف الخلايا إلى طبق به آبار مغلفة باللامينين PO / FN. قم بتغذية الخلايا كل يوم ب 200 ميكرولتر من متوسط ENC لكل سنتيمتر مربع من مساحة سطح البئر حتى أيام 30 إلى 40. لوحظت كرات عائمة حرة عالية الجودة ذات أسطح ناعمة بعد تحريض القمة العصبية.
عبرت الأجسام الكروية عن علامة القمة العصبية SOX10. لوحظت الخلايا العصبية بين الأيام 25 إلى 30 أثناء تحريض الخلايا العصبية المعوية.
