التصوير البؤري والقياسات المشبكية لتحليل تقليم الكبيبات المشبكية المشبكية المعتمدة على الخبرة

للبدء ، خذ شريحة وأضف شريحتين رفيعتين من الشريط اللاصق على الوجهين إليها للتحضير للتصوير. ماصة ما يقرب من 10 إلى 15 ميكرولتر من وسط التركيب بين شريطين من الشريط لتركيب الدماغ. انقل أدمغة ذبابة الفاكهة على شريحة مجهرية بطرف ماصة P20 مضمضوف مسبقا ب PBS و 0.2٪ Triton X-100.

بمجرد نقل الأدمغة ، استخدم فرشاة رسم دقيقة لمواءمتها ، مع التأكد من أن فصوص الهوائي متجهة لأعلى. بعد توجيه الأدمغة ، قم بتغطيتها بغطاء زجاجي. بعد ذلك ، املأ جوانب غطاء الغطاء بوسيط تثبيت إضافي.

أغلق حواف غطاء الغطاء بطلاء أظافر شفاف. بعد تجفيف الشريحة جيدا ، قم بتخزينها في الثلاجة للتصوير اللاحق. استخدم مجهرا متحد البؤر للمسح بالليزر مزودا بهدف غمر الزيت 63X للتصوير.

استخدم ليزر الأرجون 488 والهيليوم نيون 543 لتصوير الكبيبات المشبكية لفص الهوائي والخلايا العصبية الحسية الشمية Or42a. تحديد الكسب البصري والإزاحة لكلتا القناتين. ضع التصوير في مركز الدماغ وركز على كبيبات VM7.

حدد موقع الثقب الموجود في منتصف الدماغ تقريبا. حدد دقة التصوير 1024 × 1024. التقط إسقاط مكدس Z متحد البؤر بالكامل من خلال فص الهوائي لضمان التقاط التعصيب الكامل للخلايا العصبية Or42a لكبيبات VM7.

قم بتحميل النمط الجيني أو الحالة المكفوفة بالصورة في فيجي. لتقسيم قنوات خط الليزر ، انتقل إلى الصورة ، وانقر فوق اللون ، وحدد تقسيم القنوات. في القناة الحسية الشمية Or42a ، قم بالتمرير عبر مكدس Z لتحديد الشرائح التي تحتوي على تعصيب الخلايا العصبية Or42a ، وتحديد بداية ونهاية التألق.

لإنشاء إسقاط شرائح مجموع يتضمن فقط شرائح مع تعصيب الخلايا العصبية Or42a ، انقر فوق صورة وانتقل إلى المكدسات. ثم ، انقر فوق مشروع Z ، وحدد مجموع الشرائح ، وأدخل النطاق المطلوب. استخدم أداة لاسو في فيجي لتتبع الخطوط العريضة لتعصيب الخلايا العصبية Or42a في كبيبة VM7.

اضرب محيط المنطقة المتتبعة في عدد شرائح مكدس Z وسمك كل شريحة لحساب حجم تعصيب الكبيبة المشبكية VM7. بعد التعرض لمدة 24 ساعة لمركبة ذات رائحة تحكم ، يستمر التعصيب الكثيف Or42a MCD: GFP في كبيبات VM7 لكلا فصوص الهوائيات. في المقابل ، يؤدي التعرض لمدة 24 ساعة لرائحة EB بنسبة 25٪ إلى تقليم كبير وفقدان حجم الكبيبات المشبكية.

تؤدي زيادة تركيز رائحة EB إلى زيادة تقليم الكبيبات المشبكية تدريجيا. أظهرت الكميات التمثيلية لهذا النطاق من تركيزات رائحة EB نتائج مماثلة لشدة التألق وحجم التعصيب.