للبدء ، قم بإزالة المكبس من حقنة سعة 50 ملليلتر ، وأدخل بولي إيثر سلفون منخفض البروتين أو مرشح معقم فلوريد البولي فينيليدين 0.45 ميكرومتر في نهاية المحقنة. باستخدام شريط مصلي سعة 25 ملليلتر ، أضف معلق الخلية HEK293T المنقولة بالفيروس العدسي إلى المحقنة وأعد المكبس برفق. ادفع المكبس ببطء واجمع المرشح في أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة الفلتر من المحقنة وتخلص منه في محلول إزالة التلوث. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول السكروز 20٪ في قاع أنبوب الطرد المركزي الفائق. بعد ذلك ، اضبط PIPETBOY على أدنى سرعة.
أمسك أنبوب الطرد المركزي الفائق بزاوية 45 درجة تقريبا وأضف ببطء الوسط المحتوي على فيروس العدس المصفى على جدار الأنبوب. راقب الفصل الواضح للطبقات عن الأنبوب. إذا كان حجم الأنبوب الكلي أقل من 29 ملليلتر ، أضف cDMEM جديدا لتجنب انهيار الأنبوب أثناء الدوران.
امسح دلو الطرد المركزي الفائق بنسبة 70٪ كحول وضع محول الأنبوب في قاع الجرافة. ثم ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في الدلو. أغلق الدلو وضعه في الرف.
قبل تبريد أجهزة الطرد المركزي الفائقة إلى أربع درجات مئوية. ضع الدلو بعناية في الدوار وقم بتشغيل الفراغ. اضبط معدل التسارع والتباطؤ على أدنى إعداد وأجهزة طرد مركزي عند 26،000 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي ، قم بإيقاف تشغيل الفراغ وإزالة الدوار بعناية دون إزعاج العينات. راقب جهاز الطرد المركزي الفائق للتأكد من عدم وجود انسكابات وتسريبات من الدلاء. صب محتوى أنبوب الطرد المركزي الفائق بحركة واحدة سلسة في حاوية النفايات.
اقلب الأنبوب على مناديل ورقية مزدوجة الطبقة لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء ، امسح الأجزاء الداخلية من الدلو بمناديل مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪ وجففها في الهواء رأسا على عقب. باستخدام المناديل الورقية ، جفف بعناية أي سائل متبقي من حافة أنبوب الطرد المركزي الفائق.
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسائط المناسبة الخالية من المصل واتركها لمدة 15 دقيقة. باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، امزج مستحضرات فيروس العدس برفق وقسمها في أنابيب لولبية سعة 1.5 ملليلتر. تخزين الاستعدادات عدسية في ناقص 80 درجة مئوية.
حقق التحضير الناجح لفيروس العدس معدل إصابة يزيد عن 95٪بجرعة خمسة ميكرولتر. يزداد متوسط كثافة الفلورسنت للخلايا المصابة مع الجرعات العالية. أسفر الحقن داخل الصفاق ل 100 ميكرولتر من مستحضر فيروس العدس عن أعلى نسبة وشدة لإشارة GFP في الخلايا البريتونية للفئران.
كشفت تجارب الدورة الزمنية مع حقن فيروس lentivirus سعة 100 ميكرولتر عن نسبة كبيرة من الخلايا المقيمة المعبرة عن GFP في اليومين الثالث والسابع ، يليها اختفاء السكان المصابين في اليوم 14.
