لإجراء تفاعلات أنبوب الاختبار المتوازية المكونة من خطوتين للتجميع المعياري القائم على كريسبر أو CRISPRmass ، تابع شق العمود الفقري المتجه المتطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 sgRNA في الخطوة الأولى من تفاعل أنبوب الاختبار. للقيام بذلك ، رتب أنابيب 0.2 ملليلتر مصنفة بشكل صحيح في كتلة تبريد من الألومنيوم على الجليد. قم بإعداد المزيج الرئيسي لعدد N من التفاعلات عن طريق خلط كميات مناسبة من Cas9 و sgRNA و Cas9 buffer والمياه المعالجة ب DEPC.
بمجرد إضافة مكونات المزيج الرئيسي معا ، دوامة نفسها لضمان الخلط المناسب. ثم قم بتدوير المزيج لأسفل وقسمة ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب 0.2 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 0.4 ميكرولتر من بلازميد cDNA / ORF البالغ 0.019 ميكرومولار إلى كل أنبوب.
احتضان تفاعلات الانقسام عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في تفاعل أنبوب الاختبار التالي ، الخطوة الثانية ، تابع إدخال وحدة UAS خاصة بالمتجه في بلازميدات cDNA / ORF الخطية الناتجة Cas9. لإعداد تفاعل الخطوة الواحدة 1.4 ميكرولتر لكل عينة ، رتب الأنابيب الموسومة 0.2 ملليلتر في كتلة تبريد من الألومنيوم على الجليد.
قم بإعداد المزيج الرئيسي لعدد N من التفاعلات عن طريق خلط كميات مناسبة من وحدة UAS والمزيج الرئيسي لتجميع التفاعل أحادي الخطوة. دوامة المزيج جيدا قبل تدويره لأسفل. ثم القسمة 0.77 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب.
أضف 0.7 ميكرولتر من بلازميد cDNA / ORF الخطي Cas9 إلى القسمة في كل أنبوب واحتضان التفاعلات عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.