بناء واسع النطاق لبلازميدات UAS-cDNA / ORF بواسطة التجميع المعياري القائم على كريسبر (CRISPRmass)

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

84 Views

•

02:25 min

•

May 17th, 2024

DOI :

10.3791/201691-v

May 17th, 2024

•

Si Xu*¹^,², Mengyu Chen*¹^,², Guang Chen¹^,³, Si Luo⁴, Wen Xue¹^,², Xuelian Liu¹^,², Jiwu Wang¹^,²^,³, Ping Wei⁴

¹Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ²Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

Transcript

لإجراء تفاعلات أنبوب الاختبار المتوازية المكونة من خطوتين للتجميع المعياري القائم على كريسبر أو CRISPRmass ، تابع شق العمود الفقري المتجه المتطابق لبلازميدات cDNA / ORF بواسطة Cas9 sgRNA في الخطوة الأولى من تفاعل أنبوب الاختبار. للقيام بذلك ، رتب أنابيب 0.2 ملليلتر مصنفة بشكل صحيح في كتلة تبريد من الألومنيوم على الجليد. قم بإعداد المزيج الرئيسي لعدد N من التفاعلات عن طريق خلط كميات مناسبة من Cas9 و sgRNA و Cas9 buffer والمياه المعالجة ب DEPC.

بمجرد إضافة مكونات المزيج الرئيسي معا ، دوامة نفسها لضمان الخلط المناسب. ثم قم بتدوير المزيج لأسفل وقسمة ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب 0.2 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 0.4 ميكرولتر من بلازميد cDNA / ORF البالغ 0.019 ميكرومولار إلى كل أنبوب.

احتضان تفاعلات الانقسام عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في تفاعل أنبوب الاختبار التالي ، الخطوة الثانية ، تابع إدخال وحدة UAS خاصة بالمتجه في بلازميدات cDNA / ORF الخطية الناتجة Cas9. لإعداد تفاعل الخطوة الواحدة 1.4 ميكرولتر لكل عينة ، رتب الأنابيب الموسومة 0.2 ملليلتر في كتلة تبريد من الألومنيوم على الجليد.

قم بإعداد المزيج الرئيسي لعدد N من التفاعلات عن طريق خلط كميات مناسبة من وحدة UAS والمزيج الرئيسي لتجميع التفاعل أحادي الخطوة. دوامة المزيج جيدا قبل تدويره لأسفل. ثم القسمة 0.77 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل أنبوب.

أضف 0.7 ميكرولتر من بلازميد cDNA / ORF الخطي Cas9 إلى القسمة في كل أنبوب واحتضان التفاعلات عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

Explore More Videos

CRISPR based Modular Assembly

CRISPRmass

Two step Test Tube Reactions

Cas9 SgRNA

CDNA ORF Plasmids

Vector specific UAS Module

Cas9 Linearized CDNA ORF Plasmids

Single step Reaction Assembly

From the series

بناء مكتبة بلازميد UAS-cDNA / ORF عالي الإنتاجية باستخدام CRISPRmass