للبدء ، احصل على خلايا THP-1 متمايزة وقم بإزالة الوسط المستهلك من آبار صفيحة الاستزراع بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، أضف وسطا خاليا من المصل يحتوي على عديد السكاريد الدهني ، أو LPS ، إلى الخلايا واحتضان اللوحة. ثم أضف محلول مخزون الأدينوسين ثلاثي الفوسفات أو ATP إلى مجموعة النماذج واحتضن اللوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، استنشق كل طاف من آبار لوحة الثقافة.
بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين بدون EDTA إلى كل بئر واحتضانها لمدة 30 ثانية. لإيقاف انفصال الخلايا ، أضف ملليلترا واحدا من وسط RPMI 1640 وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة خمسة ملليلترات. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد PBS ، ضع الأنبوب مع الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق وأجهزة الطرد المركزي. لإعادة تعليق الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 1X وانقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة خمسة ملليلترات. احتضان أنابيب التحكم والنموذج مع الكواشف المناسبة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
لإنهاء الحضانة ، أضف 400 ميكرولتر من PBS إلى الأنبوب ودوامة بلطف. قم بتصفية تعليق الخلية في شبكة نايلون 35 ميكرومتر مثبتة على أنبوب مستدير القاع سعة خمسة ملليلتر من البوليسترين. اغمس غطاء زجاجي نظيف في محلول شبة الكروم لمدة ساعتين وجففه في فرن 37 درجة مئوية.
قم بتكسير الخلايا التربسينية كما هو موضح سابقا ، وقم بتثبيت الخلايا ب 500 ميكرولتر من المجهر الإلكتروني المثبت لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية. بعد جمع الخلايا من المحلول الثابت ، قم بتكسيرها عند 300 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وفجر الخلايا برفق.
أسقط تعليق الخلية على غطاء زجاجي واتركه لمدة خمس دقائق. نضح كل طافها وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف 500 ميكرولتر من محلول تثبيت حمض الأوسميك 1٪.
بعد ساعة واحدة ، استنشق كل طاف. بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بتجفيف العينات بتركيزات متزايدة من الإيثانول. قم بتشغيل مجفف النقطة الحرجة ، وافتح خزان ثاني أكسيد الكربون ، وقم بتبريد الغرفة إلى 10 درجات مئوية.
لف العينة بسرعة بورق الترشيح وضعها في الحجرة عندما يكون ضغط الغرفة صفر رطل لكل بوصة مربعة. بمجرد أن تستقر درجة الحرارة إلى 35 درجة مئوية ويصل الضغط إلى 1،250 رطلا لكل بوصة مربعة ، قم بإزالة الضغط عند 100 رطل لكل بوصة مربعة في الدقيقة. أخرج العينة عندما يكون ضغط الحجرة صفرا.
أخيرا ، باستخدام شريط موصل ، قم بتركيب العينات على المجهر الإلكتروني للمسح ، حاملات عينات الألمنيوم التي تستخدم مبرمج الرش. قم بتغطية العينات بطبقة من الذهب من 2 إلى 5 نانومتر. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أنه بعد تحفيز LPS / ATP ، زادت الخلايا في منطقة QT بشكل كبير مما يشير إلى موت الخلايا.
أظهرت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة لسطح غشاء البلازما خصائص البيروبتوسيس ، بما في ذلك فقاعة الغشاء والتمزق في الخلايا المحفزة LPS / ATP ، بينما بدت خلايا التحكم طبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تحفيز LPS / ATP إلى ظهور خصائص موت الخلايا المبرمج في الخلايا مثل فحم الغشاء وانكماش الخلايا ، ولوحظت الخلايا ذات خصائص التنخر بما في ذلك تورم الخلايا وتمزق الغشاء.
