للبدء ، عزل وقنية الأوعية الليمفاوية المساريقية للفئران القتل الرحيم. الضغط على الأوعية الليمفاوية في غرفة الوفرة والسماح لهم بالتوازن وتطوير تقلصات عفوية مستقرة. ثم احتضان الأوعية الليمفاوية مع استر Fura-2-acetoxymethyl وحمض pluronic لمدة 30 دقيقة في الظلام.
بعد الحضانة ، أفرغ حجم الحمام الكامل بفراغ الضغط السلبي وأعد تعبئته بمحلول الملح الفسيولوجي المطابق لدرجة الحرارة والخالي من الكاشف ثلاث مرات. ثم احتضان الأوعية الليمفاوية في الظلام لمدة 15 دقيقة إضافية لإزالة أي مؤشر زائد والسماح بإزالة الأسترة. انقل الحجرة إلى مجهر فلوري مقلوب مع ضوء LED وهدف فلور 20XS ومحول ذاتي الإطار وكاميرا لالتقاط مضان 15 هرتز.
قم بتوصيل المجهر بجهاز كمبيوتر مزود ببرنامج تصوير لتسجيل التألق وإجراء اكتشاف الحافة. قم بتنشيط مصدر ضوء LED وواجهة نظام الفلورسنت. الآن قم بتشغيل البرنامج IonWizard.
ضمن علامة التبويب ملف ، حدد الخيار جديد. ثم انتقل إلى علامة التبويب تجميع وحدد تجربة. قم بتحميل القالب التجريبي المطلوب وانقر فوق موافق. انقر فوق الزر ابدأ الموجود أسفل الشاشة لبدء التجربة.
بعد ذلك ، اضبط عمليات التتبع التي تظهر على الشاشة لعرض قطر الوعاء ، والبسط ، وإشارة 340 ، والمقام ، وإشارة 380 ، والنسبة بترتيب تنازلي. لتعديل مقياس المحور ص للحصول على مرئيات تتبع أفضل، انتقل إلى عمليات التتبع، وتأكد من إلغاء تحديد الحدود التلقائية وحدد تحرير حدود المستخدم. حدد المعلمة المراد ضبطها، وأدخل القيم الدنيا والقصوى للمحور، ثم حدد موافق للتأكيد.
باستخدام برنامج الكشف عن الحواف ، اضبط الإضاءة بحيث يظهر جدار الأوعية الليمفاوية كخطوط داكنة. حدد منطقة اهتمام أو عائد استثمار خالية من الدهون والحطام ، وتأكد من عدم تحريك عائد الاستثمار هذا. اضبط العتبة بحيث يتم اكتشاف حافة جدار الوعاء طوال دورة الانكماش بأكملها.
بعد تنشيط أنبوب مضاعف الصور ، باستخدام مصابيح LED ، يتناوب الأطوال الموجية 340 و 380 نانومتر والتعرض 50 مللي ثانية لإثارة Fura-2. التقط أطياف الانبعاث عند 510 نانومتر و 15 هرتز عبر مجال التصوير بأكمله. لقياس نسبة الإشارة إلى الخلفية ، احصل أولا على مضان 340 و 380 مع وجود الوعاء الليمفاوي في وسط مجال الرؤية.
ثم انقل مجال الرؤية إلى حافة الحمام بدون وعاء لالتقاط الخلفية. بعد ذلك ، استبدل محلول الاستحمام بمحلول ملح فسيولوجي مطابق لدرجة الحرارة وخالي من الكاشف لإزالة مؤشر Fura-2 الزائد. سجل إشارة الفلورسنت الأساسية Fura-2 والانقباضات التلقائية لمدة 30 دقيقة تقريبا.
ثم سجل استجابة التركيز التراكمي للنيفيديبين واحصل على قياسات خلفية لكل تركيز دواء. في نهاية كل تجربة ، اغسل الأوعية الليمفاوية بمحلول ملح فسيولوجي مطابق لدرجة الحرارة وخالي من الكالسيوم للحصول على الحد الأدنى من إشارة الفلورسنت Fura-2 والحد الأقصى لقطر الأوعية الليمفاوية في حالة عدم وجود أيونات الكالسيوم. استبدل محلول الاستحمام بمحلول ملح فسيولوجي مطابق لدرجة الحرارة يحتوي على 10 ملليمولار من أيونات الكالسيوم والأيونوميسين للحصول على أقصى إشارة فلورية Fura-2 والحد الأدنى لقطر الأوعية الليمفاوية في ظروف تشبع أيونات الكالسيوم.
أظهرت المعلمات ، بما في ذلك سعة ارتفاع الكالسيوم ، والكالسيوم الأساسي ، وذروة الكالسيوم انخفاضا يعتمد على التركيز مع الإضافة الإضافية للنيفيديبين إلى غرفة التروية. في الوقت نفسه ، أظهرت المعلمات المقلصة ، مثل الانكماش والسعة والتدفق المحسوب ، انخفاضا تدريجيا. أظهرت مخططات مانهاتن استجابات الأوعية الليمفاوية الفردية لمقاييس الإيقاع ، بما في ذلك الفاصل الزمني ووقت الانكماش ووقت الاسترخاء.
