للبدء ، استرجع أنبوبين للحفظ بالتبريد يحتويان على خلايا جذعية متوسطة دهنية بشرية مجمدة عند الممر الثالث من النيتروجين السائل. حركها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب تماما. ثم تطهير الأنابيب باستخدام 75 ٪الكحول.
ضع الأنابيب المطهرة على طاولة فائقة التنظيف. باستخدام ماصة ، نضح تعليق الخلية ونقله إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في جهاز طرد مركزي منخفض السرعة عند 250 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
في هذه الأثناء ، قم بإعداد أربعة أطباق استزراع 10 سم وأضف تسعة ملليلتر من الوسط إلى كل طبق. ضع علامة على الاسم ونوع الخلية والجيل وتاريخ التجربة في كل طبق. ثم سخنها مسبقا في حاضنة خلايا ثرموستاتية 37 درجة مئوية.
بمجرد انتهاء الطرد المركزي لمدة خمس دقائق ، قم بتطهير أنبوب الطرد المركزي قبل نقله إلى طاولة فائقة التنظيف. باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية وإضافة أربعة ملليلتر من الوسط لتحقيق تركيز الخلية المطلوب. حرك المحلول برفق حتى يتشتت بالتساوي.
بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى كل طبق مسخن مسبقا ورجه عن طريق تحريكه على سطح مستو في نمط متقاطع. راقب الخلايا عند تكبير 40x تحت المجهر الضوئي قبل وضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، راقب حالة الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 40x قبل الشروع في إعداد وسيط التبادل.
بعد التطهير ، انقل أطباق الاستزراع إلى طاولة فائقة النظافة مع مستوى السلامة البيولوجية 2. قم بإزالة الوسط من كل طبق ثقافة. شطف الطبق بلطف مع ملليلتر من محلول PBS مرتين وإضافة 10 ملليلتر من المتوسطة إلى كل طبق.
انقل الخلايا إلى الحاضنة حتى تصبح جاهزة لجمع المواد الطافية.
