للبدء ، قم بتجميع مجهر تشريح ، وملقطين بأطراف دقيقة ، ومقص ، وإبرة حقنة ملليلتر واحد ، وورق ترشيح على منصة عمل. بعد ذلك ، باستخدام مقص الكوع ، قم بنواة العينين من فأر مخدر. ضع العينين في طبق زجاجي يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد و 0.2٪ حمض البكريك في 0.1 محلول فوسفات مولاري.
على المجهر التشريحي ، باستخدام حقنة واحدة ملليلتر ، لكمة ثقب في ليمبوس القرنية وقطع الجزء الأمامي بالمقص. استخدم الملقط لإزالة العدسة من سطح الشبكية الداخلي. الآن باستخدام ملقطين ، قشر الصلبة بعناية حتى يتم عزل شبكية العين تماما عن كأس العين.
في وقت لاحق ، قطع شبكية العين إلى أربع قطع. بعد التثبيت الليلي ومحلول بارافورمالدهيد 4٪ ، اغسل أنسجة الشبكية في 0.01 مولار PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. احتضان أنسجة الشبكية في 1٪ بوروهيدريد الصوديوم في 0.01 مولار PBS لمدة 30 دقيقة.
مرة أخرى ، اغسل أقسام الشبكية في 0.01 مولار PBS ست مرات على الأقل. ثم قم بإزالة الجسم الزجاجي باستخدام ورق الترشيح. وباستخدام شفرة حلاقة ذات حدين ، قم بتقطيع شبكية العين إلى أقسام صغيرة بين 100 و 300 ميكرومتر.
اغسل خطوط الشبكية في 0.01 وحدة تلفزيونية مولية ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها قبل احتضانها بالكاشف A والكاشف B من مجموعة ABC لمدة يومين. بعد ذلك ، اغسل خطوط الشبكية في 0.05 وحدة عازلة ثلاثية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. احتضان خطوط الشبكية مسبقا باستخدام 5٪ كاشف 1 و 5٪ كاشف 3 من ثنائي أمينوبنزين ، أو مجموعة DAB ، في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
لتلطيخ خطوط الشبكية باستخدام DAB ، أضف نفس الحجم من المحلول من ثلاثة أنابيب في مجموعة DAB بالتسلسل. تحت مجهر التشريح ، لاحظ حالة التلطيخ. اغسل شرائط الشبكية بمحلول 0.05 تريس المولي ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
أخيرا ، اغسل الشرائط في 0.01 مولار PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. في تجارب التحكم ، لم تظهر عنيقات مخروطية ذات شريطين وقضيب كروي بشريط واحد أي تفاعل مناعي في غياب الأجسام المضادة الأولية. حدد بروتين كيناز C ألفا الخلايا ثنائية القطب في شبكية العين.
يعرض حامل DAB وجود بروتين كيناز C alpha وتشعبات الخلايا ثنائية القطب ، مما يشكل نقاط اشتباك عصبي مع أطراف قضيب ومخروط في الطبقة الضفيرية الخارجية. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد منتج تفاعل DAB في تحديد نهايات الخلايا ثنائية القطب للقضيب والعمليات المحورية في الطبقة الضفيرية الداخلية. تبين أن خلايا الأمكرين ذات النشاط المناعي للمادة P هي خلايا أماكرين سالبة قبل المشبكي للمادة P.
علاوة على ذلك ، كانت خلايا أماكرين ذات النشاط المناعي للمادة P بعد المشبكية إلى الطرفات ثنائية القطب في الطبقة الفرعية الثالثة والطبقة الفرعية خمسة مستويات من الطبقة الضفيرية الداخلية ، على التوالي.
