للبدء ، احتضان أنبوب يحتوي على أنسجة الحصين الفأر منفصلة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. انقل تعليق الخلية الغائمة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من محلول مزيج الغسيل.
بعد ذلك ، مرر العينة من خلال مرشح 70 ميكرومتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة خمسة ملليلتر قبل الطرد المركزي مرة أخرى. إخضاع العينة للطرد المركزي المتدرج Percoll ، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلطيخ MACS ، واحتضانها. الآن ، ماصة واحد ملليلتر من MACS العازلة للعينة قبل الطرد المركزي.
ثم, تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS. بعد ذلك ، اشطف أعمدة التحديد الموجبة للفاصل المغناطيسي بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS. ضع برفق 500 ميكرولتر من تعليق الخلية على عمود.
بعد غسل الأعمدة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت MACS ، ضع الأعمدة على أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر. أضف خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت MACS على العمود. بعد ذلك ، قم بطرد العينات عند 300 جرام لمدة 10 دقائق ، ثم أضف ملليلتر واحد من DMEM المسخن مسبقا إلى الحبيبات.
نقل 500 ميكرولتر من تعليق الخلية النهائي إلى آبار لوحة 24 بئر. استبدل 250 ميكرولترا من كل بئر ب DMEM الطازج المسخن مسبقا. ثم أضف ثلاثة ميكروغرامات من المشابك العصبية ذات العلامة الحمراء pHrodo عبر الوسائط.
أضف نفس الحجم من المشابك العصبية غير المسماة إلى عناصر التحكم السالبة. بعد الحضانة ، اغسل الآبار باستخدام DPBS البارد. الآن ، ماصة 200 ميكرولتر من التربسين-EDTA في كل بئر.
بعد حضانة مدتها 35 ثانية ، ماصة ملليلتر واحد من DPBS تحتوي على FBS في كل بئر. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة خمسة ملليلتر من خلال مصفاة ، ثم اغسل كل بئر مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS المثلج. جمعت أجهزة الطرد المركزي عينات عند 500 جرام لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، احتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ لمدة 10 دقائق على الجليد. بعد ذلك ، أضف CD11b و CD45 إلى محلول التلوين لعمل تركيز نهائي من 1 إلى 100. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام.
ماصة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS في العينة ، ثم إخضاعها للطرد المركزي النهائي عند 300 جرام لمدة 10 دقائق قبل تحليل التدفق الخلوي. لوحظ مضان PE إيجابي مماثل لتلك التي تم الحصول عليها من المشابك العصبية عند الرقم الهيدروجيني 4 في الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية CD11b و CD45 الإيجابية.
