بعد توليد مزرعة خلايا MCF-7 التي يسببها بيروكسيد الهيدروجين ، تخلص من المادة الطافية من طبق الاستزراع. أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ورج الطبق برفق قبل التخلص من برنامج تلفزيوني. أضف الآن ملليلتر واحد من التربسين لغسل الخلايا ، وهز الطبق وانتظر لمدة دقيقة واحدة ، ثم تخلص من التربسين.
اضغط برفق على الطبق ، ولاحظ حركة الخلية في الورقة لتأكيد الانفصال. بعد ذلك ، أضف أربعة ملليلتر من وسط الثقافة الكامل وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي التعليق في 800G لمدة خمس دقائق وإزالة طاف.
أضف 200 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الحبيبات ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم بإجراء دورات تجميد ذوبان متكررة لتعطيل الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلية محللة في 1500G لمدة 10 دقائق وجمع طافت لتحليلها.
قم بإذابة كواشف ELISA في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل بدء الفحص ، سخن قارئ ELISA قبل 15 دقيقة من الاستخدام. قم بتخفيف محلول الغسيل المركز المطلوب 20 مرة بالماء منزوع الأيونات إلى محلول عملي. قم بإعداد حلول العمل للعينات القياسية واخلطها بعناية لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعة.
أضف 50 ميكرولترا من محلول العمل القياسي وعينات الكشف بتركيزات مختلفة إلى آبار التفاعل ، باستثناء الآبار الفارغة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكشف عن بيروكسيديز الفجل إلى كل بئر تفاعل. أغلق الآبار بختم صفيحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة.
تخلص من السائل المتبقي في الآبار واتركه حتى يجف على ورق ماص. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لكل تفاعل جيد. بعد دقيقة إلى دقيقتين ، تخلص من المخزن المؤقت قبل إضافة 50 ميكرولترا من الركائز A و B إلى كل تفاعل جيد.
ختم اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام. بعد 15 دقيقة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول التوقف لكل تفاعل جيد. قم على الفور بقياس قيمة الكثافة الضوئية عند الطول الموجي 450 نانومتر باستخدام قارئ ELISA.
أظهر تأثير بيروكسيد الهيدروجين على صلاحية خلايا MCF-7 أن العلاج ب 0.75 مليمولار لمدة 12 ساعة قلل من الصلاحية إلى 67٪ بتركيز أعلى يبلغ 1.5 مللي مولار ، انخفضت صلاحية الخلية بشكل كبير إلى أقل من 3٪ أظهرت خلايا MCF-7 بعد زيادة تركيز معالجة بيروكسيد الهيدروجين مستويات متزايدة من 8-Oxo-dG ، مما يوضح تأثير الإجهاد التأكسدي على تلف الحمض النووي.
