للبدء ، انقل المبايض المستأصلة من الزرد إلى صفيحة من ستة آبار تحتوي على ملليلتر من محلول تفكك الخلايا. احتضان المبايض عند 28.5 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. أضف ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من وسط L15 المسخن مسبقا إلى المخزن المؤقت لإيقاف الهضم.
بعد ذلك ، ضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر في بئر آخر من لوحة ستة آبار. أضف وسيط L15 إلى البئر ، مما يضمن أن المستوى المتوسط أعلى من المصفاة. الآن ، استخدم ماصة لرسم وسط الهضم من خلال مصفاة الخلية.
إزالة الوسط الزائد مع ماصة. أضف أربعة ملليلتر من وسط L15 الطازج إلى البئر ، وأعد تعليق البويضات برفق. بعد بضع دقائق ، ماصة من طاف.
لاختيار البويضات لمراقبة الجودة ، قم بنقلها إلى طبق بعرض 35 ملم يحتوي على وسط L15 طازج. راقب البويضات تحت المجهر الضوئي باستخدام تكبير 10X أو أكثر. استخدم أداة حقن حادة لإزالة أي شظايا خلوية أو بويضات المرحلة الأولى أو أي بويضات مرحلة أخرى.
لتأكيد مرحلة النمو ، أضف Hoechst 33342 إلى الوسط L15 الذي يحتوي على البويضات واحتضانها. مراقبة البويضات مع المجهر مضان تحت الإثارة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. اختر بعناية البويضات التي لا تفي بالمعايير المطلوبة بإبرة.
أظهر المبيض اليافع وفرة من بويضات المرحلة الأولى الشفافة مصحوبة بعدد أقل من بويضات المرحلة الثانية. أظهرت مبيض الأسماك البالغة غلبة المرحلة المتأخرة غير الشفافة من اثنين إلى ثلاث بويضات. نتج عن الطريقة المرجعية العديد من نوى الخلايا الحبيبية الملطخة على سطح البويضات التي تغلف البويضات بكثافة.
في المقابل ، سمحت الطريقة المعدلة بفصل بويضات المرحلة الأولى الخالية من تلطيخ نوى الخلايا الحبيبية.
