للبدء ، قم بتعقيم سطح خنافس Monochamus alternatus و Tribolium castaneum المتعطشة لمدة 24 ساعة باستخدام المبيض والإيثانول والماء المقطر. للحث على العدوى الفطرية ، أولا ، اغمر أغصان الصنوبر أو نخالة القمح في التعليق المخروطي لمدة 10 ثوان. ثم اغمس الخنافس في التعليق الكونيدي.
بعد التجفيف ، ضع خنفساء واحدة وغصين واحد في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر. قم بتربية الخنافس في حاضنة غير رطبة عند 25 درجة مئوية. بعد الحضانة ، انقل الخنافس الميتة إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر ، وضع قطعة من القطن المعقم الرطب داخل الأنبوب.
تشريح أجسام الخنفساء المصابة بالعدوى الفطرية إلى أوضاع مثل الهوائيات والرأس والصدر والبطن والأجنحة والساقين. قطع سدادات قرصية خمسة ملليمترات من المستعمرات الفطرية الناضجة. ضع أنسجة الخنفساء المصابة في جلوتارالدهيد مبرد مسبقا بنسبة 2.5٪ عند أربع درجات مئوية لمدة يومين.
بعد ذلك ، اغسل العينات ثلاث مرات في محلول فوسفات 0.1٪ لمدة خمس دقائق وجففها في زيادة تركيزات الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل منها. جفف العينات في مجفف تجميد الفراغ ، ثم راقب الهياكل الفطرية تحت المجهر الإلكتروني الماسح. عالج نخالة القمح بتعليق كونيدي لمدة 10 ثوان وبعد التجفيف ، انقلها إلى طبق بتري.
مغمورة خنافس T.castaneum في التعليق الكونيدي لمدة 10 ثوان قبل وضعها في طبق بتري الذي يحتوي على نخالة القمح. بعد الحضانة ، عد الخنافس الميتة من اللوحة. استخراج الحمض النووي الجينومي للفطريات الطفيلية المسببة للأمراض الحشرية باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الجينومي للفطريات.
باستخدام مجموعات معينة من البادئات ، قم بإعداد خليط تفاعل تفاعل PCR للتضخيم الخاص بالجينات. بعد التسلسل ، قم بمحاذاة تسلسل النوكليوتيدات باستخدام ClustalX 2. أخيرا ، قم بإجراء تحليل النشوء والتطور باستخدام MEGA 6 بناء على طريقة الاحتمال الأقصى.
تسببت الفطريات الطفيلية مثل Aspergillus austwickii و Akanthomyces attenuatus و Scopulariopsis alboflavescens في أعراض عدوى كبيرة في M.alternatus. كما دعمت ملاحظات SEM الخصائص المورفولوجية لهذه الفطريات الطفيلية على سطح الخنافس. أظهر النشاط الممرض للحشرات معدلات وفيات أعلى بكثير في الفطريات الطفيلية مقارنة بالمجموعة الضابطة.
أظهرت شجرة النشوء والتطور متعددة الجينات مسافات وراثية بين الأنواع الفطرية الطفيلية الثلاثة والأنواع الأخرى داخل أجناسها.
