التجزئة الخلوية لجزر بنكرياس المكاك الريسوس لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والأيض

للبدء ، قم بإذابة أنسجة جزيرة البنكرياس بقرود المكاك الريسوس المعزولة على الجليد. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل 0.1X إلى حبيبات الأنسجة. باستخدام مدقة بيليه خالية من RNase يمكن التخلص منها ، قم بتجانس الأنسجة برفق 15 مرة على الجليد.

احتضان العينة على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى التجانس ، واخلطه برفق مع ماصة على الثلج. قم بتجهيز مرشح ما قبل الفصل 30 ميكرومتر مع 300 ملليلتر من المخزن المؤقت للغسيل ، وقم بتصفية ملليلتر واحد من التجانس الخلوي في أنبوب سعة خمسة ملليلترات.

قم بتدوير التجانس المصفى عند 500 جرام لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية. باستخدام ماصة ، انقل ملليلترا واحدا من المادة الطافية إلى cryovial على الجليد ، وقم بتجميده على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتجارب الأيض المستقبلية. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للغسيل بالتنقيط إلى حبيبات النوى لإعادة تعليقها.

قم بتدوير الحبيبات المغسولة عند 1،000 جرام لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية. بعد تكرار الغسيل ، أعد تعليق النوى في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل. باستخدام ماصة ، امزج 10 ميكرولتر لكل من تعليق النوى و 0.4٪ Trypan Blue في أنبوب منفصل ، وأضف الخليط إلى شريحة عداد الخلايا الآلية.

وأخيرا، باستخدام عداد الخلية، أوجد تركيز النوى. تم الحصول على نواة سليمة مثالية لتجارب التسلسل. بناء على دراسات التعبير الجيني ، تم الحصول على تجميع UMAP للأنواع الفرعية الخلوية داخل جزر الرئيسيات الجنينية المعزولة وغير البشرية.

تم الحصول على وفرة مستقلب الجزيرة ، مثل فوسفات ثنائي هيدروكسي أسيتون ، والجلسرين 3-فوسفات ، و 2-أوكسوغلوتارات ، والكرياتين ، والجلوتاثيون باستخدام الكسور الخلوية.