لإصابة ثقافات السالمونيلا بالبكتيريا العاثية ، قم بتخفيف ثقافة السالمونيلا المعوية بين عشية وضحاها في حجم نهائي يبلغ خمسة ملليلتر من LB وإضافة 0.1 ملليلتر من البكتيريا المحضرة مسبقا تحلل العاثيات إليها. ثم احتضان عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلتر ، قم بتخفيف الثقافة البكتيرية التي تحتوي على العاثيات 100 مرة في خمسة ملليلتر من 0.22 ميكرون رطل مصفى. أجهزة الطرد المركزي التعليق لمدة 10 دقائق في 2،377g.
صب بعناية طاف، وترك بعض الحجم في القاع لضمان وجود الخلايا. اغسل الخلايا البكتيرية ب 10 ملليلتر من وسط LB المصفى 0.22 ميكرون. بعد تكرار الطرد المركزي والغسيل ثلاث مرات ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من LB المصفى. استخدم نظام ترشيح فراغي لتصفية 50 ميكرولتر من المعلق البكتيري الذي تم الحصول عليه من خلال مرشح معقم 0.45 ميكرون.
شطف المرشح مع 100 ملليلتر من LB.To المصفى تسهيل إطلاق العاثية من الخلايا البكتيرية ، واحتضان المرشح الذي يحتوي على الخلايا دون تفكيك النظام. شطف الفلتر مرة أخرى ، كما هو موضح سابقا ، باستخدام نظام الترشيح بالفراغ. لاستعادة الخلايا البكتيرية من المرشح باستخدام ملقط معقم ، انقل المرشح إلى قارورة.
ثم أضف ملليلتر من 2x LB فوق المرشح والماصة عدة مرات لتحرير الخلايا من الفلتر. أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من هذا التعليق لمدة دقيقتين في 10،354g. بعد التخلص من المادة الطافية ، اغسل الخلايا ثلاث مرات بمليلتر واحد من وسط LB المصفى.
ثم أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من 2x رطل. بعد ذلك ، امزج عديد السكاريد الشحمي التجاري للسالمونيلا المعوية ، أو LPS ، مع 20 ميكرولترا من المعلق البكتيري في ملليلتر واحد من LB المصفى. احتضن المزيج لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة لمنع الإصابة بالبكتيريا العاثية مرة أخرى. بعد ذلك ، قم بنقل ملليلتر واحد من الثقافة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأجهزة الطرد المركزي التعليق لمدة دقيقتين عند 10،354 جم. اغسل الحبيبات ثلاث مرات بمليلتر واحد من وسط LB المصفى.
بعد الغسيل ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من 2x رطل. أضف 20 ميكرولترا من هذا المزيج إلى ملليلتر واحد من LB المصفى ، يحتوي على 0.8 ملليغرام لكل ملليلتر من LPS التجاري. واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، بيليه واحد ملليلتر من الثقافة في أنبوب الطرد المركزي عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين في 10،354g.
بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام LB المصفى ، أعد تعليقها في ملليلتر واحد من LB المصفى. باستخدام نظام الترشيح الفراغي ، قم بتمرير ملليلتر واحد من التعليق البكتيري من خلال مرشح معقم 0.45 ميكرون وشطف المرشح باستخدام 100 ملليلتر من LB المصفى. انقل المرشح إلى قارورة باستخدام ملقط معقم. أضف ملليلتر من 2x LB فوق المرشح والماصة عدة مرات لتحرير الخلايا من الفلتر. أجهزة الطرد المركزي ملليلتر واحد من الخلايا لمدة دقيقتين في 10،354g قبل غسلها ثلاث مرات مع LB المفلترة. أعد تعليق الخلايا المجمعة في ملليلتر واحد من 2x LB.To تحضير اللقاح الخالي من العاثيات ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا من المعلق البكتيري إلى 900 ميكرولتر من LB تحتوي على 0.45 ملليغرام لكل ملليلتر LPS.
احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة. استخدم هذا كقسمة لتأكيد عدم وجود إصابة العاثيات. من خلال إجراء المعايرات في مراحل مختلفة من البروتوكول ، لوحظ أن الغسيل المتكرر والترشيح لم يكونا كافيين للقضاء على عاثيات البكتيريا من الثقافات.
ومع ذلك ، انخفض عدد العاثيات بمجرد استخدام خطوة الحضانة مع LPS التجارية. كانت الخطوة الحاسمة للإزالة الكاملة للعاثيات البكتيرية في الثقافة البكتيرية هي الحضانة الثانية مع LPS التجاري.
