للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت للغسيل عن طريق استكمال محلول الملح المتوازن من Hank بمحلول أكوام 10 مليمول. قم بتخزين المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. تحضير ظهارة الشبكية الصبغية أو وسط RPE في DMEM والتسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
ضع الفأر المقتل رحيما بشكل مسطح على جانبه مع توجيه العين لأعلى. ضع السبابة فوق العين والإبهام تحتها. اضغط برفق على بنية العظام حول العين لتتسبب في بروز مقلة العين.
أدخل طرف المقص المفتوح قليلا تحت العين وقم بتدوير المعصم برفق بعيدا عن العين 90 درجة حتى تنفصل العين عن التجويف. ضع العين على الفور ولف في 70٪ إيثانول لمدة خمس ثوان. ثم انقل العين إلى مخزن مؤقت للغسيل يتم الاحتفاظ به على الجليد.
تحت مجهر تشريح ، ضع العين في طبق بتري مملوء بمحلول غسيل وشرائط من الشاش المنقوع. تثبيت العين عن طريق عقد العصب البصري مع ملاقط واستخدام سكين جراحي بلطف جعل شق على مستوى أورا سيراتا. أدخل مقص Vannas في الشق واقطع حول محيط Ora Serrata حتى تتم إزالة الجزء الأمامي والجسم الزجاجي.
انزع الشبكية برفق من كوب العين باستخدام ملقط مربوط دون إزعاج طبقة RPE. بمساعدة المقص ، قم بإزالة العصب البصري والأنسجة الضامة الزائدة من كأس العين دون ثقب كأس العين. انقل كوب العين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من 0.25٪ تربسين و 0.02٪ EDTA.
احتضان كوب العين في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. كل دقيقتين ، قم بإزالة الأنبوب واضغط بقوة على الجزء السفلي 40 مرة على سطح العمل. بعد الحضانة ، باستخدام ماصة AP-1000 ، اخلطها برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لتعطيل كوب العين.
لتحييد التربسين ، قم على الفور بوضع طبقات من صفائح RPE المنفصلة ، باستثناء كوب العين على 0.5 ملليلتر من FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. ثم قطرة قطرة ، إضافة وسائط RPE إلى طبقات أوراق FBS و RPE لتخفيف التربسين. أجهزة الطرد المركزي RPE في 340G لمدة ثلاث دقائق.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في كمية مناسبة من وسائط RPE للحصول على 24 صفيحة بئر. احتضان RPE عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. بعد 24 ساعة من عزل RPE ، تبدأ الخلايا المصطبغة النواة في الاستقرار دون الالتزام الكامل.
على مدار 48 إلى 72 ساعة ، تلتصق هذه الخلايا وتنتشر ، وتحتفظ بالتصبغ الداكن في نواة شفافة. بعد خمسة أيام ، تظهر خلايا RPE زيادة في الطلاقة المشتركة في البدء في تشكيل جهات اتصال من خلية إلى خلية تتشكل في طبقة أحادية مستقطبة ذات هياكل سداسية. أظهر RPE المعزول نقاء كما يتضح من علامة RPE المحددة وسلامة التقاطع الضيق بعد ستة أيام في الثقافة.
