للبدء ، احصل على 250 ملليغرام من SAT فوق العضلة الصدرية الرئيسية أثناء زرع CIED في محلول تخزين الأنسجة لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. تحضير ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الكولاجين / ديسباز في 10 ملليلتر من محلول الملح المتوازن هانكس البارد. تحت خزانة التدفق الصفحي ، قم بفرم الأنسجة إلى قطع ملليمتر مكعب واحد في 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين / Dispase.
أضف 4.5 ملليلتر من محلول الكولاجين / Dispase إلى المزيج وانقل الأنسجة المسحنة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 ملليلتر. اغسل غطاء طبق بتري بخمسة ملليلتر من محلول الكولاجين / ديسباز وأضفه إلى الأنبوب. احتضان الأنبوب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في دوار أنبوب مضبوط على 20 دورة في الدقيقة.
لوقف عملية الهضم ، صب 10 ملليلتر من وسائط نمو الخلايا البطانية الكاملة في الأنبوب. بعد سحن المزيج المهضوم بقنية Venflon عيار 14 ، قم بتصفيته من خلال غربال خلية 70 ميكرومتر وشطفه ب 10 ملليلتر من المخزن المؤقت 0.5٪ PBS-BSA. أجهزة الطرد المركزي المرشح في 300G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف المياه.
لإزالة الخلايا الميتة ، أضف 200 ميكرولتر من حبات إزالة الخلايا الميتة إلى حبيبات الخلية المأخوذة في أنبوب طرد مركزي دقيق ، واحتضانها. ثم قم بتوصيل عمود فصل السائل بفلتر 30 ميكرومتر بمغناطيس الفاصل وضع أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر تحته. بعد غسل العمود بمخزن مؤقت ملزم لإزالة الخلايا الميتة ، أضف عينة تعليق الخرزة.
دعها تمر تحت الجاذبية وجمع الشحم. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلية الحية المجمعة وإعادة تعليق الحبيبات الناتجة في 400 ميكرولتر من 0.5٪ PBS-BSA. احتضان الخلايا العالقة ب 20 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المطلية ب CD31 عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من 0.5٪ PBS-BSA. قم بتوصيل عمود بفلتر 30 ميكرومتر بمغناطيس الفاصل وضع أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر تحته. أضف تعليق ميكروبيدات الخلية إلى العمود واتركه يمر تحت الجاذبية.
بعد غسل العمود ، ضعه في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر وأضف ملليلتر واحد من 0.5٪ PBS-BSA إلى العمود. ادفع مكبس العمود لجمع الكسر الموجب CD31. قم بطرد العينة كما هو موضح سابقا وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسائط نمو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الكاملة.
قم بتوزيع التعليق في بئرين من صفيحة 24 بئر مطلية بالجيلاتين. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين إلى أربعة أسابيع حتى تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا.
