مقايسة التحول الحراري للكشف عن التفاعلات الجزيئية لبروتين السيلينوبروتين O

للبدء ، تحضير محلول سيلينوبروتين باستخدام مقايسة التحول الحراري أو المخزن المؤقت TSA. قم بتوزيع البروتين والجزيئات الصغيرة وصبغة SYPRO Orange على الآبار المناسبة للوحة 384 بئرا. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف بصريا وقم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة عند 1،000 جم لمدة دقيقة واحدة في جهاز طرد مركزي.

ثم ضع اللوحة في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وقم ببرمجتها لعقد العينة عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها زيادة 0.5 درجة في درجة الحرارة في الدقيقة حتى 95 درجة مئوية. تصدير البيانات من جهاز RT PCR لوحدات التألق النسبية أو RFU فيما يتعلق بدرجة الحرارة. باستخدام البرنامج المختار ، قم باستخراج ورسم نقاط البيانات حتى أعلى كثافة تم قياسها لكل منحنى ذوبان.

تحديد درجة حرارة الانصهار مع ملاءمة بولتزمان السيني للبيانات لتحديد درجة حرارة الانصهار أو Tm.أشارت منحنيات التمسخ الحراري إلى زيادة أربع درجات مئوية في Escherichia coli SelO في وجود ATP مع أيونات المغنيسيوم وارتفاع 12 درجة مئوية في نفس ATP مع أيونات المنغنيز. ومع ذلك ، لم يكن هناك تحول في الاستقرار الحراري عند الحضانة مع UTP ، مما يشير إلى أن Escherichia coli SelO قد لا تظهر ارتباطا يمكن اكتشافه ب UTP. كان للبروتين الخالي من البروتين وكذلك عناصر التحكم في عدم الصبغة إشارة مضان منخفضة ، والتي لم تكن تستجيب لزيادة درجة الحرارة.