للبدء ، قم بإعداد محلول طلاء يحتوي على عامل نمو مخفض لمصفوفة الغشاء القاعدي ووسط ثقافة عضوي بنسبة واحد إلى اثنين. أضف 115 ميكرولترا من محلول الطلاء إلى كل بئر من صفيحة 48 بئرا وضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة مرطبة. بالنسبة لطريقة الكولاجين ، أضف ملليلتر واحد من هلام الكولاجين إلى إدخال غشاء داخلي 30 ملم ، واتركه يتجمد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.
لحصاد الخليط الخلوي ، اغسل أنسجة سرطان الجلد التي تم استئصالها حديثا في طبق بتري سعة 10 ملليلتر يحتوي على وسط غسيل يوضع فوق الثلج. باستخدام ملاقط معقمة ، انقل الورم إلى طبق ثان مع وسيط غسيل للغسيل التالي فوق الثلج. خلال دورات الشطف الثلاث باستخدام مقص معقم وشفرة ، قم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون والدم المتبقي.
ضع الورم في طبق بتري فارغ وفرمه جيدا بشفرات معقمة. ثم انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط الهضم المحضر. ضع المخروط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ودوامة كل خمس دقائق.
بعد 25 دقيقة ، أضف 30 ملليلتر من وسط ADMEM / F12 الذي يحتوي على 10٪ FBS لإيقاف عملية الهضم. بعد ذلك ، قم بتصفية تعليق الخلية المهضومة من خلال مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرومتر وشطف المصفاة بمكمل ADMEM / F12. باستخدام ماصة ، استرجع أي وسائط متبقية في الجزء السفلي من الفلتر.
ثم بيليه الخلايا عند 300 × جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع العضوي. للزراعة ، بذرة 200،000 خلية في الآبار المطلية بماتريجيل قبل الحرب تستكمل ب 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع العضوي.
بدلا من ذلك ، يتم خلط 1 مليون خلية بذرة مع ملليلتر واحد من هلام الكولاجين على غشاء هلام الكولاجين المتصلب مسبقا في صفيحة من ستة آبار وإضافة وسط الثقافة العضوية إلى البئر. لمرور 150 إلى 200 ميكرومتر عضوي ، قم بنقلها إلى مخروطي 15 ملليلتر واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني من Dulbecco. الطرد المركزي الخليط في 300 × غرام لمدة سبع دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد إزالة المادة الطافية ، احتضان المواد العضوية مع بديل التربسين وتخلط بعد كل ثلاث دقائق. لإيقاف عملية الهضم ، أضف ADMEM / F12 مع وسط مصل مخفض يحتوي على 10٪ FBS. الطرد المركزي الخليط في 300 × غرام لمدة سبع دقائق ، وإعادة تعليق الحنك في وسط الثقافة العضوية.
أخيرا ، قم بزرع معلق الخلية المفردة في بئر جديد أو مطلي بالكولاجين بنفس كثافة البذر الأولية للحضانة. أشارت الصور المجهرية للعضويات في وقت متأخر من Matrigel في اليوم الثاني واليوم السابع إلى أن حجم المواد العضوية زاد تدريجيا. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن هناك تمييز ذو دلالة إحصائية في نسبة خلايا ألفا بيتا تي بين أورام الوالدين والكائنات العضوية المعنية المزروعة في أي من الماتريجل أو الكولاجين.
