للبدء ، خذ طبقا زجاجيا بغطاء محكم. ضع كرة قطنية في الطبق. تحت غطاء الدخان ، أضف ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من إيثيل الأثير إلى كرة القطن.
قم بتغطية الطبق على الفور بالغطاء. استخدم فرشاة الرسم لالتقاط يرقات ذبابة الفاكهة الثالثة من قوارير الذباب. نقل يرقة واحدة في وعاء صغير مفتوح.
ضع الحاوية في الطبق الزجاجي مع إيثيل الأثير ، وأغلق الطبق على الفور بإحكام. استخدم مجهر التشريح لفحص اليرقة للتنقل كل 30 ثانية. نقل اليرقة المخدرة على شريحة المجهر الزجاجي.
اغمر اليرقات في قطرة من محلول الحشرات المالحة. تحت المجهر تشريح. قم بإزالة معظم المحلول الملحي بمنديل ورقي.
ضع الجانب الظهري لليرقة لأعلى لاستئصال الألياف العملاقة ، أو الجانب البطني لأعلى لاستئصال TTMn. ثم خفض ببطء غطاء زجاجي ينزلق على اليرقة. أضف محلول ملحي إلى جانب قسيمة الغطاء.
لملء الفراغ بين الشريحة الزجاجية وانزلاق الغطاء. لاستئصال الألياف العملاقة ، تحقق من وضع الدماغ تحت التكبير العالي على مجهر التشريح. تأكد من أن الدماغ مستلق ومرئي من خلال بشرة.
لإزاحة أي نسيج دهني يغطي الدماغ ، استخدم الملقط لتطبيق ضغط طفيف على انزلاق الغطاء وتحريك انزلاق الغطاء من جانب إلى آخر. ضع العينة على مرحلة مجهر متعدد الفوتونات. استخدم مرشح GFP لتحديد موقع العينة في وضع التألق.
لاستئصال الألياف العملاقة ، ركز على الخلايا ذات الاهتمام ، ثم قم بالتبديل إلى وضع الفوتون. اضبط الليزر على 870 نانومتر واضبط كسب الكاشف لعرض خلايا التعبير عن GFP باستخدام ماسح Galvano ، وحدد منطقة الاجتثاث باستخدام منطقة دائرية ذات أهمية. بعد ذلك ، تابع إعداد بروتوكول الاجتثاث في البرنامج ، للقيام بذلك ، قم بتعيين إطار واحد للاكتساب بالتتابع ، والتحفيز ، متبوعا بإطار آخر للاستحواذ.
ابدأ تشغيل طاقة ليزر التحفيز بقيمة أقل وقم بتشغيل بروتوكول التحفيز. إذا لم ينجح الاجتثاث وقام بتبييض الخلية فقط ، فقم بزيادة طاقة الليزر بزيادات قدرها 5٪ أو عدد الحلقات واحدة تلو الأخرى ، وقم بتشغيل البروتوكول مرة أخرى. افعل ذلك حتى يتم رؤية الاجتثاث الناجح للخلايا.
بعد إزالة الخلية بنجاح ، قم بإزالة قسيمة الغطاء. باستخدام فرشاة الرسم ، التقط اليرقات برفق من الشريحة ، ثم انقل اليرقات إلى قارورة طعام. في عينات الاجتثاث الألياف العملاقة.
تم التحقق من الاجتثاث من خلال عدم وجود سوما المسمى GFP على الجانب المستأصل من الدماغ. لليرقات المستأصلة TTMn. تم التعرف بسهولة على غياب TTMn على جانب واحد بسبب فقدان السوما والتشعبات.
