الرحلان الكهربائي لهلام اليوريا بولي أكريلاميد (PAGE) لفحص أنشطة إنزيم الحمض النووي التي تستخدم قليل النوكليوتيدات التجارية

للبدء ، قم بإعداد مخزون من 20٪ من مادة الأكريلاميد واليوريا السبعة مولار ومحلول 1X TBE. بالنسبة لهلام واحد ، امزج 10 ملليلتر من محلول الأكريلاميد واليوريا مع 100 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم وثلاثة ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين ، وقم بصبها في عجلة هلام. بعد أن يصلب الجل ، قم بتشغيل الجل مسبقا في مخزن مؤقت 1X TBE لمدة 30 دقيقة بمعدل 10 مللي أمبير لكل هلام مع تسخين خارجي.

باستخدام ماصة باستور ، اغسل 1X TBE في آبار الهلام لإزالة اليوريا الزائدة. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل ، وقم بتشغيله لمدة ساعة إلى 1.5 ساعة عند 45 إلى 55 درجة مئوية. تصور الجل مع الإعدادات الصحيحة للفلوروفور المختار.

أخيرا ، حدد شدة نطاق المنتج والركيزة باستخدام ImageJ ، واحسب النسبة المئوية للمنتج باستخدام الصيغة. أدى نشاط إنزيم ربط الحمض النووي إلى زيادة في حجم قليل النوكليوتيد من 20 نيوكليوتيدات إلى 40 نيوكليوتيدات لوحظت على هلام اليوريا PAGE. ربط إنزيم الحمض النووي البكتيري ركائز الحمض النووي المشقوقة وغير المتطابقة ويمكنه استخدام كل من المغنيسيوم والمنغنيز لنشاط الربط مع تفضيل المغنيسيوم.