للبدء ، في غطاء زراعة الخلايا ، أضف الشحوم الدهنية المحصودة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر. نقل شفط الدهون إلى حقنة قفل لور معقمة 20 ملليلتر. ثم قم بتوصيل موصل 1.4 ملم بالمحقنة.
الآن قم بتوصيل حقنة قفل Luer ثانية سعة 20 ملليلتر بالجانب المقابل للموصل. ادفع الأنسجة الدهنية من حقنة إلى أخرى حوالي 30 مرة. ثم نقل الدهون المستحلبة إلى أنبوب طرد مركزي جديد 50 ملليلتر.
طرد مركزي الدهون في 500 غرام لمدة 10 دقائق. ثم تخلص من الطبقة العليا الزيتية. اجمع الطبقة المركزية النقية التي تحتوي على طبقة الأوعية الدموية اللحمية المنفصلة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.
الآن ملء أنبوب الطرد المركزي مع DMEM المكمل حتى علامة 40 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 500 غرام لمدة خمس دقائق. اجمع طبقة mSVF الناتجة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر.
في أنبوب معقم 1.5 ملليلتر ، ماصة 100 ميكرولتر من جزء الأوعية الدموية اللحمية المعزولة. لهذا ، أضف 10 ميكرولتر من الثرومبين ، ثم ماصة 10 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم. أخيرا ، أضف 70 ميكرولترا من حمض الترانيكساميك إلى المزيج.
باستخدام طرف ماصة جديد ، أضف 10 ميكرولتر من الفيبرينوجين إلى الأنبوب قبل وقت قصير من التطبيق. بعد بلمرة خليط هيدروجيل mSVF ، ماصة 200 ميكرولتر من هيدروجيل في لوحة 12 بئر لأغراض تحليلية. أضف الآن 100 ميكرولتر من هيدروجيل الفيبرين في بئر واحد كعنصر تحكم سلبي.
احتضان الصفيحة المكونة من 12 بئرا عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط الثقافة الدافئة مسبقا إلى كل بئر. ضع اللوحة المكونة من 12 بئرا مرة أخرى في الحاضنة مرة أخرى لمدة أربع ساعات.
أضف ريسازورين ملليلتر واحد إلى كل بئر قبل الحضانة مرة أخرى لمدة 24 ساعة. ماصة عينات resazurin في لوحة 96 بئر. في اليوم التالي ، استخدم قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع لتصوير الخلايا لقياس شدة التألق الأولى.
للتحليل النسيجي في الأيام الأول والثالث والسابع ، احتضان هيدروجيل الفيبرين في 0.5 ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهيد. أضف الآن 1٪ PBS إلى الطبق وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية. تم إجراء مقايسة resazurin لتحديد صلاحية الخلايا في المختبر لجزء الأوعية الدموية والهيدروجيل.
أظهر الجزء الوعائي انخفاضا في القدرة على البقاء في اليوم الثالث ، في حين ظل مزيج mSVF-fibrin hydrogel قريبا من خط الأساس. بحلول اليوم السابع ، انخفضت صلاحية mSVF ، بينما زادت تركيبة mSVF-fibrin hydrogel. أظهر التحليل النسيجي عدم وجود انخفاض في عدد نوى الخلايا في اليومين الثالث والسابع.
أظهر هيدروجيل الفيبرين الحد الأدنى من التدهور مع مجموعات الخلايا المرئية الموزعة بالتساوي.
