لبدء تحويل خلايا الإشريكية القولونية BL21 DE3 ، قم بإذابة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية المختصة على الجليد. أضف ميكرولتر واحدا من الحمض النووي لبلازميد pET 28a Sumo TRF2 إلى تعليق الخلية المختصة ، وقم بتدوير الأنبوب برفق لخلط التعليق. بعد التحول ، انشر 100 ميكرولتر من تعليق الخلية على صفيحة أجار لوريا بيرتاني ، أو LB ، التي تحتوي على 50 ميكروغراما لكل مليلتر كاناميسين.
احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة من الخلايا المحولة ، وزرعها في خمسة ملليلتر من وسط LB ، مع استكمال 50 ميكروغرام لكل مليلتر كاناميسين. احتضان لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة ، قم بتحفيز المزرعة باستخدام IPTG واحد مليمولار كتركيز نهائي. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 17 ساعة لتعزيز التعبير عن البروتين. قم بتحميل مستخلصات البروتين الخام ، جنبا إلى جنب مع مخزن التحميل ، على جل SDS-PAGE.
قم بتشغيل العينات في البداية عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة ، متبوعة ب 120 فولت لمدة 50 دقيقة في مخزن مؤقت ثلاثي الجلايسين. ثم قم بتلطيخ اللون الأزرق Coomassie لتصور تعبير البروتين. لتنقية البروتين ، قم بالطرد المركزي لمستخلص البروتين الخام عند 38 ، 000 جم لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
قم بتحميل المادة الطافية المفلترة على عمود النيكل المتوازن مسبقا في المخزن المؤقت للربط. اغسل العمود بمخزن مؤقت ملزم وقم بمسح البروتين بتدرج إيميدازول المحضر ، واجمع 12 جزءا من مليلتر واحد لكل منهما. أضف الجلسرين إلى التركيز النهائي بنسبة 50٪ إلى البروتين المركز والمخزن المؤقت للتخزين.
تم إثبات التعبير عن TRF2 في الإشريكية القولونية بنجاح ، كما هو موضح في SDS-PAGE ، حيث ظهرت نطاقات مميزة تتوافق مع TRF2 قبل وبعد الحث.
