وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.

1. البنود التي تحتاج إلى تحضير قبل الانتقال إلى خلية التصفيحات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعدة المتوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو إذابة وقسامة من متوسطة NeuroCult المصل خالية NCFC دون السيتوكينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وارتفعت درجة حرارة تصل في المتوسط ​​في حمام ماء C ° 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد حلول المخزون من عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل النمو الأساسي ليفية (B - FGF) في تركيز 10 ميكروغرام / مل والهيبارين عند 0.2 ٪ في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حجم التجربة ، هناك حاجة لعدة أطباق زراعة الأنسجة 35mm إلى الخلايا لوحة وهناك حاجة أيضا واحدة طبق بيتري 150 - 200cm البلاستيك لاجراء الأطباق مكررة 35mm وطبق third 35mm للمياه. </li></ol> 2. خلية التحضير : اعتمادا على التجربة الخاصة بك ، يمكن أن تكون على استعداد خلايا من مصدر أخلاقي أو الجنينية (النسيج الأساسي أو فصلها neurospheres فصلها). تشريح الأنسجة من الكبار / الماوس الجهاز العصبي المركزي الجنينية (CNS) ، أو فصل neurospheres الكبار / الجنينية المستمدة من قبل كما هو موضح 1،2 ثم : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تمرير تعليق خلية واحدة من خلال شبكة تصفية 40 ميكرون الحجم وذلك لإزالة كتل غير فصلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط 10μl لتعليق الخلية مع 90μl التريبان الأزرق لإجراء تعداد خلايا ملاحظة : يمكن أيضا اخرى التخفيفات الخلية المناسبة يتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الجنينية الأولية أو الكبار الخلايا العصبية المشتقة منها ، تمييع تعليق خلية إلى تركيز 6.5 × 5 10 خلايا / مل في المتوسط ​​NSC كاملة. إذا باستخدام خلايا من neurospheres نأت المستمدة من الخلايا العصبية الجنينية أو أخلاقي ، تمييع تعليق خلية إلى تركيز 2.2 X 5 10 خلايا / مل في المتوسط ​​NSC كاملة. </li></ol> 3. الطلاء في خلايا متوسطة N - CFCA شبه الصلبة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط حجم مناسب من المكونات التالية بالترتيب ، اعتمادا على عدد من يعيد. نحن هنا مزيج المبلغ اللازم لمدة متماثلة أو مكررة الأطباق. لأعداد إضافية من يعيد ، يرجى الرجوع إلى الجدول 1. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.7 مل من مصل NeuroCult متوسطة خالية NCFC دون السيتوكينات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 330 ميكرولتر ملاحق NeuroCult انتشار NSC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.6 ميكرولتر من EGF (10μg/mL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 32 ميكرولتر من البنسلين / الستربتوميسين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب ب 3.3 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل ، (10μg/mL) إلا إذا استنبات الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب 3.3 ميكرولتر من الهيبارين (0.2 ٪) فقط إذا زرع الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25μL التعليق الخلية (الخلايا من 2.2 × 5 / 10 مل من الخلايا neurospheres فصلها أو 6.5 × 10 الخلايا / 5 مل من الخلايا الأولية أنسجة الجهاز العصبي المركزي فصلها) ملاحظة : يجب أن الأرقام النهائية الخلية مطلي يكون حوالي 2500 خلية لكل 35 مم طبق الثقافة لneurosphere الخلايا المشتقة والخلايا 7500 بنسبة 35 ملم لصحن الثقافة الخلايا الأولية. في بعض الحالات ، والطلاء النهائية كثافة الخلية لابد من تعديلها من خلال إجراء تجربة معايرة الخلية. للتحليلات الإحصائية ، وينبغي أن العدد الكلي للمستعمرات اكتشافها بعد 21 يوما من ثقافة تكون ضمن مدى لا يقل عن 50-150 المستعمرات. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط المتوسط ​​تحتوي على خلايا بلطف ثم يتم نقل 1.3 مل من محلول الكولاجين الباردة إلى تعليق الخلية ويمزج جيدا بواسطة pipetting طيف لتجنب إدخال أي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل هو الاستغناء مختلطة لمركز كل صحن الثقافة 35mm (~ 1،5 مل / صحن) ويتم ترجيح كفة باستخدام الأطباق بلطف بحركة دائرية على السماح للخليط موزعة بالتساوي على سطح الطبق. . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع مكررة الثقافة 35 ملم في أطباق بتري ملم لوحة 100. تتم إزالة غطاء صحن جديد 35 مم ويوضع طبق أيضا مفتوحة في نفس طبق بيتري 100 ملم. يضاف الماء المعقم لهذا الطبق فتح 35 ملم للحفاظ على الرطوبة الأمثل خلال فترة الحضانة. تستخدم لوحات الأحيائي مربع (245 ملم) عندما تم تعيين أكثر الأطباق تكرار 35 ملم يصل. مرة أخرى ، وتشمل 2 أو 3 مفتوح 35 ملم الأطباق التي تحتوي على الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل لوحات لمجموعة الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO2 والرطوبة 95 ٪. سوف congeals الكولاجين بواسطة زيادة درجة الحرارة وتشكيل هلام تحدث في غضون ساعة واحدة تقريبا. لا ينبغي ان ينزعج الثقافات خلال هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضين الخلايا المستنبتة لمدة 21 يوما (يمكن أن تكون هناك اختلافات في حجم مستعمرة التمييز بوضوح بعد 21 يوما). </li></ol> 4. إعداد متوسطة التجديد وتغذية الثقافة : كما يتم تحضين N - CFCA الثقافات لفترة ممتدة من الزمن (21 يوما) ، يجب أن يكون الطعام مع الثقافات NeuroCult الكامل المناسبة أعد المتوسطة التجديد جديدة على النحو التالي : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم خلط 4.5 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل مع 0.5 متريضاف L ملاحق NeuroCult انتشار NSC ثم عوامل النمو : </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 ميكرولتر من EGF 10μg/mL (لإعطاء تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل EGF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المطلوب 125 ميكرولتر من 10μg/mL ب FGF - (لإعطاء تركيز النهائي من 0.25μg/mL ب FGF -) إلا إذا زرع الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 ميكرولتر من الهيبارين بنسبة 0.2 ٪ ، إلا إذا كان المطلوب زراعة الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 60 ميكرولتر من المناسب استكمال NeuroCult متوسطة التجديد (للخلايا الجنينية أو الكبار) في مركز كل طبق NCFC الفحص مرة كل 7 أيام خلال الفحص كامل NCFC حضانة الثقافة (21 يوما). </li></ul> 5. سجل المستعمرات الفحص N - CFC المشتقة وحساب تواتر NSCs حسن النية والخلايا العصبية السلف : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع كل ثقافة 35 مم طبق على طبق التهديف الموزعة مع حجم الشبكة ملم 2.0 ملم 2.0 x و ثم يتم وضعها كل من الاطباق على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستخدم طاقة منخفضة (2.5X -- 5X) هدف العدسة ، يتم تفحص كل طبق وسجل المستعمرات القائمة على أحجامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنف مستعمرات في فئتين رئيسيتين : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقل من 2 ملم القطر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ≥ 2 مم </li></ol></li></ul> 6. ممثل النتائج : كما هو الحال في مقايسة neurosphere ، مطلي في الخلايا N - CFC مقايسة تبدأ تتكاثر وجعل مستعمرات صغيرة من الخلايا في غضون 3 -- 7 أيام بعد الطلاء (الشكل 1). في غضون اسبوعين ، يمكن التمييز بين المستعمرات من أحجام مختلفة. في حين أن الغالبية العظمى من المستعمرات تميل لوقف تزايد بعد 14 يوما ، وبعض المستعمرات تستمر في الزيادة في الحجم. قبل 21 يوما ، ويمكن أن تصنف مستعمرات في واحدة من الفئات الأربع : 1) أقل من 0.5 مم ، 2) 0،5-1 مم ، 3) 1-2 مم و 4) ≥ 2mm وفي القطر. عمليا ، ويشار إلى المستعمرات أصغر من قطر 2 مم إلى ما سلف مشتقة (الشكل 2) والمستعمرات ويشار في القطر ≥ 2mm وباسم مجلس الأمن القومي مشتقة (الشكل 3). عدد المستعمرات في القطر ≥ 2mm والخلايا في مجموع مطلي ، يمثل تواتر حسن النية الفعلية الخلايا الجذعية العصبية على المدى الطويل من تجديد الذات والقدرات المتعددة المحتملة. وقد قدرت مجموع neurosphere تشكيل التردد في خلية معينة من السكان بعد يوم 7-8 في تجربة وكالة الامن القومي موازية لتكون مشابهة لتشكيل مستعمرة مجموع السكان تردد نفس الخلية بعد 21 يوما في تجربة N - CFCA. وN - CFCA ومع ذلك ، يوفر شرطا أكثر تساهلا ، وذلك كل خلية يمكن أن تظهر إمكاناته الكاملة التكاثري. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكون </td><td> 2 يتطابق </td><td> 3 مكررات </td><td> 4 مكررات </td></tr><tr><td> NeuroCult NCFC المصل خالية متوسطة دون السيتوكينات </td><td> 1700 </td><td> 2550 </td><td> 3400 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC ملاحق الانتشار </td><td> 330 </td><td> 495 </td><td> 660 </td></tr><tr><td> EGF (10 ميكروغرام / مل) </td><td> 6.6 </td><td> 9.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> bFGF (10 ميكروغرام / مل) ، فقط لخلايا البالغين </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> هيبارين محلول (0.2 ٪) ، فقط لخلايا البالغين </td><td> 3.3 </td><td> 4.95 </td><td> 6.6 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستبرتوميسين (1:100) </td><td> 32 </td><td> 48 </td><td> 64 </td></tr><tr><td> الخلايا على العنوان التالي : 2.2 × 10 5 مثقف خلايا / مل أو 6.5 × 10 5 الخلايا الأولية / مل </td><td> 25 </td><td> 37.5 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> الكولاجين الحل </td><td> 1300 </td><td> 1950 </td><td> 2600 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مكونات ثقافة كاملة مقايسة N - CFC. <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. المستعمرات الممثل في N - CFCA ثقافة NSCs مرور الماوس one E14 بعد 7 أيام من الطلاء. قد المستعمرات عرض مختلفة مورفولوجيا والحجم. التكبير الأصلي ؛ 4X <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. المستعمرات السلف الممثل المستمدة من مختلف الأحجام في N - CFCA ثقافة NSCs مرور الماوس one E14 21 يوما بعد الطلاء. كما هو مبين ، والمستعمرات مورفولوجية مختلفة ولكنها كلها أقل مم 2 في الحجم. التكبير الأصلي ؛ 4X <img src="/files/ftp_upload/2639/2639fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. الممثل الخلايا الجذعية النية الحسنة المستمدة مستعمرة في N - CFCA ثقافة مرور الماوس NSCs one E14 21 يوما بعد الطلاء. قد مستعمرات الخلايا الجذعية المستمدة عرض التشكل المختلفة (انظرشريط الفيديو) ، ولكن كلها 2mm و≥ في القطر. التكبير الأصلي ؛ 4X

<ol>
	<li>Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay.">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Neural+Stem+and+Progenitor+Cells+in+the+Neural+Colony+Forming+Cell+Assay.">Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay.</a> Stem Cells. , (2008).</li><li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain.">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li><li>Louis, S. A., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+and+Neural+Colony-Forming+Cell+Assays.">Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays.</a> Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).</li></ol>

ينتمي واحد من المؤلفين ، لويس ألف شارون ، مع StemCell تكنولوجيز المحدودة ، الشركة المنتجة لبعض الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة.

على الرغم من أن الفحص neurosphere 3،1،2 هو الأسلوب الأكثر شيوعا لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من مصادر متنوعة مثل الأنسجة الجنينية الكبار والجهاز العصبي المركزي ، فإنه لا يمكن قياس دقيق تردد مجلس الأمن القومي في مجتمع مختلط من الخلايا العصبية السلائف (الجذعية و الأسلاف) ، وليس هناك علاقة بين 1-1 عدد neurospheres وعدد الخلايا الجذعية النية الحسنة 4. لمعالجة هذا القيد ، وقد تم تكييفها وكالة الامن القومي الأصلي وذلك للسماح للالجذعية العصبية والأسلاف ليصل إلى قدرتها الانتشار الكامل لمدة ثلاثة أسابيع 5-7. على عكس وكالة الامن القومي السائل ، في N - CFCA هي في الواقع مستمدة clonally المستعمرات ، ومصفوفة الكولاجين شبه صلبة تمنع هجرة الخلايا واحد مطلي وتجميع المستعمرات. لنتائج متسقة مع هذا الاختبار فإننا نوصي بما يلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان وجود خلية واحدة في التعليق على التعليق الخلية الأصلية. تمر بك تعليق خلية واحدة من خلال شبكة تصفية 40 ميكرون الحجم وذلك لإزالة كتل غير فصلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبقي الحل الكولاجين على الجليد أو في البراد +4 درجات مئوية. الكولاجين هو العنصر الأخير لتضاف إلى خليط من التعليق الخلية كما congeals عن طريق زيادة درجة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تنس أن تغذي ثقافة كل أسبوع. مضيفا أن التجديد المتوسطة تحتوي على عامل النمو (ق) مرة واحدة كل 7 أيام يسمح للخلايا أن يواصل الانتشار على مدى فترة ممتدة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تحسين الطلاء النهائية كثافة الخلايا لخلايا المستمدة من الخلايا العصبية سواء الأولية أو مثقف بحيث يكون العدد الكلي للمستعمرات اكتشفت بعد 21 يوما من تاريخ الثقافة في NCFC - A ضمن مجموعة لا تقل عن 5-20 المستعمرات. هذا النطاق يسمح الكشف عن المستعمرات NSC نادرة مشتقة&gt; 2mm وقطرها في العينات مع توفير أعداد كافية من المستعمرات للتحليلات الإحصائية. اعتمادا على مصدر خلية البداية ، أقل بكثير (&lt;50) وارتفاع أعداد المستعمرات يتم الحصول عليها في بعض الأحيان (&gt; 250). ومستعمرات قليلة جدا نتيجة في 2mm و&gt; المستعمرات في القطر يتم الكشف عن المستويات ، في حين أن العديد من المستعمرات أيضا سوف يؤدي إلى اكتظاظ anddepletion مكونات النمو المتوسطة مما أدى إلى فرز مستعمرة دقيقة. ولذلك سوف الخلية كثافة الطلاء يجب أن يتم تعديلها وفقا لذلك (أي زيادة أو تخفيض العدد الكلي للخلايا مطلي) </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NeuroCult NSC Basal Medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NSC Proliferation Supplements</td>
<td>Medium supplement</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NeuroCult NCFC medium</td>
<td>Medium</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>05720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.05% 	trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soybean trypsin inhibitor </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer </td>
<td>Sieve</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep </td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T25 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>136196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T80 flask</td>
<td>Culture ware</td>
<td>Nalge Nunc international</td>
<td>178905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen</td>
<td>Reagent </td>
<td>STEMCELL</td>
<td>04902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>2028-EG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>b-FGF</td>
<td>Growth factor</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>3139-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>Growth factor</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784</td>
<td>Reconstituted in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352096</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm culture dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded scoring dishes</td>
<td>Culture ware</td>
<td>STEMCELL</td>
<td>27500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells

في مقايسة neurosphere (NSA) هي واحدة من أكثر الوسائل استخداما لعزل وتوسيع وأيضا حساب تواتر من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). علاوة على ذلك ، كما تم هذا النظام ثقافة خالية من المصل المستخدمة لتوسيع تحديد الخلايا الجذعية وتواترها من مجموعة متنوعة من الأورام والأنسجة الطبيعية. فقد تبين مؤخرا أن هناك علاقة واحد الى واحد غير موجود وبين تشكيل neurosphere NSCs. هذا يشير إلى أن وكالة الأمن القومي كما هو مطبق حاليا ، يغالي في تواتر NSCs في يسكنها خليط من الخلايا العصبية السلائف معزولة عن كل من المخ الجنينية لدى الثدييات وتعليم الكبار. هذا الفيديو يوضح عمليا الكولاجين رواية تقوم شبه صلبة مقايسة ، والعصبية مستعمرة تشكيل خلية مقايسة (N - CFCA) ، والذي لديه القدرة على تمييز الخلايا الجذعية من السلف على أساس المحتملة على المدى الطويل التكاثري ، وبالتالي يوفر طريقة تعداد تردد مجلس الأمن القومي. في N - CFCA ، تستمد المستعمرات ≥ 2 مم وقطرها من الخلايا التي تفي بجميع المعايير الفنية لمجلس الأمن القومي ، في حين يتم اشتقاق المستعمرات &lt;2mm ومن الأسلاف. ويمكن استخدام هذا الإجراء N - CFCA لخلايا المعدة من مصادر مختلفة بما في ذلك الكبار الابتدائي والمثقف أو الخلايا الجنينية الماوس الجهاز العصبي المركزي. هنا نستخدم خلايا المعدة من إحدى الفقرات neurospheres المتولدة من يوم 14 الفئران الجنينية لأداء الدماغ N - CFCA. وتتجدد مع ثقافات المتوسط ​​انتشار كل سبعة أيام لمدة ثلاثة أسابيع للسماح للخلايا مطلي لعرض إمكاناتها التكاثري كامل ثم يتم حساب تواتر السلف العصبية وحسن النية الخلايا الجذعية العصبية على التوالي عن طريق حساب عدد المستعمرات التي هي &lt;2mm و وتلك التي هي 2mm و≥ في اشارة الى عدد من الخلايا التي كانت مطلية في البداية.

Watch this Scientific Journal Video about Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells at JoVE.com

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية تميز بحسن نية وتعداد الخلايا الجذعية العصبية في يسكنها خليط من الخلايا العصبية باستخدام السلائف فحص الخلايا العصبية المكونة للمستعمرة.

العصبية تشكيل مستعمرة الفحص الخلوي : إن الفحص تميز بحسن نية الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا العصبية السلف

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

neural-colony-forming-cell-assay-an-assay-to-discriminate-bona-fide

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.0K Views.  University of Florida. هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية تميز بحسن نية وتعداد الخلايا الجذعية العصبية في يسكنها خليط من الخلايا العصبية باستخدام السلائف فحص الخلايا العصبية المكونة للمستعمرة.

Video: Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

تعداد الخلايا الجذعية العصبية باستخدام نسيلي فحوصات

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...