ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RR021905 P20 - 01 ، CF RPD STANTO07R0 منحة ، وناسا NNH09ZNE002C المنحة.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تخطيطي لسيسي - MS تحليل المواد المتطايرة البكتيرية. غير المشردين فراغ الرأس من ثقافة البكتيرية التي CO 2 (1) في دائرة رد الفعل سيسي (2). كما المتطايرة اجتياز دائرة رد الفعل سيسي أنها تمر من خلال سحابة electrospray وتصبح مؤينة (3). المؤينة مرة واحدة ، يتم سحبها من المواد المتطايرة في مطياف الكتلة لتحليل (4). يتم تمرير الغاز الناقل الزائدة والمواد المتطايرة البكتيرية غير المتفاعل من خلال مرشح 0.22 ميكرون (5) ، وكتدبير إضافي للحماية ، وإعادتها إلى غطاء الكيميائية. أقحم : الإبرة electrospray سيسي هو السيليكا الشعرية (40 معرف ميكرون) مع طرف الإبرة شحذ. كدليل على استخدام سيسي - MS لتوصيف المواد المتطايرة البكتيرية ، E. القولونية K12 و P. تستزرع PAO1 الزنجارية هوائيا لمدة 24 ساعة في 50 مل لينوكس في LB - 37 درجة مئوية ويتم جمع أطياف سيسي MS - المتطايرة من فراغ الرأس في 2 دقيقة. ويستخدم غاز ثاني أكسيد الكربون (99.99 ٪) بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة والغاز الناقل عن تسليم متقلبة إلى دائرة رد الفعل. كان رد فعل الغرفة المخصصة سيسي بناء وتركيب لAPI - 3000 (SCIEX) ، ليحل محل أيون electrospray الأصلي المصدر. يتم جمع الأطياف في وضع ايون ايجابية باستخدام حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، والميثانول 5.0 ٪ ، والمياه 94.9 ٪ (V / V) كحل electrospray ، ألقاه في 5 NL / ثانية من خلال السيليكا غير موصل الشعرية مع طرف الإبرة شحذ (40 معرف ميكرون). التيار الكهربائي المطبق هو 2.5 كيلو فولت. يستخدم المحلل 1.4.2 البرمجيات التطبيقية (النظم البيولوجية) لجمع البيانات مع المعلمات التالية : 2-50 دا ، MCA واسطة ، وبفحص 40 ، 3 ق / المسح الضوئي ، و 2 من الوقت دقيقة التحليل الكلي. 1. نظام زراعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار السفينة المناسبة لنمو الثقافات الخاص ، والنظر في متطلبات نمو الأنواع في تجربتك (مثل التهوية والضوء والحرارة وغيرها) ، فضلا عن كفاءة في توفير المواد المتطايرة في مطياف الكتلة. الزجاجات الثقافة نختار لاستخدام القياسية 100 مل بيركس زجاجات وسائل الاعلام مزودة القبعات الخيوط التي لديها ما لا يقل عن اثنين من الموانئ luer. يتم إدراج خط مدخل من خلال منفذ واحد للتسليم الغاز luer الناقل للزجاجة العينة ويتم إدخال خط مخرج من خلال منفذ آخر للتسليم المركبات العضوية المتطايرة في الصك (الشكل 1). أي منافذ إضافية موصولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل زرع العينات ، الضغط على السفن وتغرق في المياه لفحص للكشف عن التسربات. تسرب الغاز هي السبب الرئيسي للنتائج شاذة في شكل إشارات ضعيفة أو غائبة ايون المتقلبة. </li></ol> 2. البيولوجية التجربة : انشاء واعتبارات السلامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الثقافات الخاص في الظروف الملائمة لفرضية الخاص. فمن المستحسن أن اثنين على الأقل يعيد البيولوجي ، مع اثنين من كل تقنية متماثلة ، تستخدم لكل متغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد فارغة لكل حالة الثقافة (متوسطة ، والمضادات الحيوية وغيرها) واحتضان فارغة تحت نفس الشروط العينات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توظيف احتياطات السلامة التي هي مناسبة للعوامل البيولوجية التي تستخدمها ، مع الأخذ بعين الاعتبار مستوى السلامة الحيوية (ق) من الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع التلوث من الصك الخاص وخطوط نقل الغاز مع عوامل بيولوجية قابلة للحياة ، تثبيت الفلاتر حجم المسام المناسبة في الخط الناقل للغاز. سوف لا تتداخل مع المرشحات نقل المواد المتطايرة إلى دائرة رد الفعل سيسي ، ولكن قد تؤثر قليلا كفاءة نقل الهباء الجوي. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الاحتواء الثانوي أو خزانة للسلامة الأحيائية عندما ربط غطاء زجاجة نقل الغاز الى ثقافتك لضمان احتواء مناسب في حالة تسرب مواد بيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء وإنهاء الناقل تدفق الغاز الى زجاجة عينتك بطريقة لن تبني الضغط داخل زجاجة. </li></ol> 3. صك التحسين ملاحظة : تم تصميمه خصيصا سيسي - MS لعينة المتطايرة ، والحد من ذلك استخدام عبق مواد العناية الشخصية (على سبيل المثال ، وكولونيا ، الفم ، والمستحضرات ، المنقي النسيج) والصمغ ، والسجائر ، وما إلى ذلك قبل استخدام الأداة. غطاء محكم جميع المواد الكيميائية المتطايرة في المختبر ، والمراقبة الجوية مسودات أكبر قدر ممكن من خلال الاختبار. سوف المعلمات التالية مفيدة ، والتي تؤثر على جميع شدة الإشارة والاستقرار ، والحاجة إلى أن يكون الأمثل لجهازك والتجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل Electrospray ومعدل التدفق : اختيار الحل المناسب لelectrospray فئة من الجزيئات التي ترغب في استهدافها ، مع الأخذ بعين الاعتبار قطبية أداة التشغيل (الوضع إيجابية أو سلبية ايون) وحرف الجزيئي للمركبات الهدف. في هذه التجربة هو الحل electrospray حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، والميثانول 5.0 ٪ ، 94.9 ٪ ماء (V / V) ، والذي يعزز من قوة إشارة الجزيئات القطبية أقل whilه توفير الاستقرار إشارة جيدة. يتم تسليم الحل بمعدل تدفق 5 NL / ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معدل تدفق الغاز الناقل : إن معدل تدفق الغاز الناقل يمكن أن تؤثر على الاستقرار electrospray وكثافة الإشارة. ويستخدم ثاني أكسيد الكربون 2 (≥ 99.99 ٪) بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شكل إبر وموقف : شكل إبر وموقف الطرف تؤثر بقوة على كثافة إشارة والاستقرار. عند تثبيت إبرة جديدة ، يجب أن يكون الأمثل للموقف إبرة لخلق توازن بين خلفية منخفضة ، وارتفاع كثافة إشارة الحليلة ، والاستقرار الإشارة. من أجل التكاثر سيسي أطياف بعد تغيير إبرة ، فمن الضروري لجمع أطياف دوريا كما يمكنك ضبط موضع الإبرة حتى تكون قادرة على المباراة الطيف لوحظ أن السجلات الخاصة بك. والمسافة من طرف الإبرة electrospray إلى فوهة تكون المواصفات الشامل 1-5 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهد المطبقة : إن الجهد الذي يتم تطبيقه على نظام يؤثر على كثافة الأيونات إشارة واستقرار المخروط electrospray تايلور. بالإضافة إلى ذلك ، الجهد الأمثل يعتمد على حل electrospray الخاص وشكل غيض الإبرة. في بداية سلسلة من التجارب الخاصة بك ، وتحديد الجهد يمكن أن ينتج الطيف الأمثل والاستقرار إشارة للنظام الخاص بك ، ومن ثم استخدام هذا الجهد لجميع التجارب اللاحقة. لنظامنا ، الفولتية المطبقة من 2،0-5،0 كيلوفولت تقديم الأمثل كثافة إشارة والاستقرار electrospray. عن هذه التجربة ويستخدم 2.5 كيلو فولت. </li></ol> 4. تشغيل وتوليف سيسي - MS للتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ عن طريق ضمان أن يتم تشغيل التيار الكهربائي وإيقاف العرض الذي تبرأ من نظام الكهرباء. القيام بذلك عن طريق 1) ضمان أضواء المؤشر في امدادات التيار الكهربائي يتم إيقاف ، 2) ضمان الجهد على المتعدد هو صفر ، و 3) ويؤدي التأريض الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت الحل المناسب لelectrospray تجربتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الغاز الناقل وضبط تدفق إلى السعر المناسب للتجربتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ممارسة الضغط على الخزان electrospray للشروع في إنجاز الحل electrospray إلى دائرة رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على توفير الجهد وضبط الجهد إلى قيمة مناسبة لإجراء التجارب الخاصة بك. </li></ol> ملاحظة : عند هذه النقطة السطوح المعدنية من مصدر التأين قادرة على توصيل صدمات خطيرة. ممارسة قدر كبير من الحذر عند العمل حول صك مرة واحدة وقد تم تشغيل التيار الكهربائي عن إمداد. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء طريقة ضبط لرصد الطيف سيسي - MS حين جعل صقل تعديلات على الجهد تطبيقها. استخدام المعلمات اقتناء أن يكون لديك الأمثل للنظام الخاص بك وتجربتك. مسح اقتناء قناة متعددة (MCA) خانة الاختيار (إن وجد) بحيث ينتج كل مسح الطيف مستقلة ، ضبط الوقت اقتناء إلى 10 -- 15 دقيقة ، والبدء في عملية الاستحواذ. وينبغي الآن أطياف الخلفية الناقل للغاز يمكن ملاحظتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل صقل تعديلات على تطبيق الجهد للحصول على مجموع مستقرة chromatogram ايون (TIC) ومسح استنساخه التي تطابق CO 2 بمسح لتجاربك السابقة. بمجرد أن يتم إجراء التعديلات الجهد ، ومواصلة جمع أطياف وTIC ألف لمدة خمس دقائق لضمان استقرار هذا الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد ضمان استقرار أساسي ، وإعداد الأسلوب المناسب لاقتناء والعينات الخاصة بك وضبط الوقت اقتناء ، ومجموعة البيانات ، واختيار MCA حسب الحاجة. خلفية جمع الغاز الطيف الناقل عن السجلات الخاصة بك. </li></ol> 5. الحصول على بصمات الأصابع المتطايرة من ثقافتك البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع طائفة فارغة ، توجيه تدفق الغاز عبر خطوط الناقل الالتفافية ، ونعلق ثم عينة فارغة (الصمامات المغلقة) لخطوط نقل الغاز من الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصمامات لزجاجة العينة ، وإغلاق الصمامات من الخطوط الالتفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للنظام للتوازن لمدة 30 ثانية ، وخلال الوقت الذي الرطوبة في دائرة رد الفعل هو الاستقرار. هذه الفترة من موازنة أمر ضروري للحصول على الأطياف استنساخه. للتأكد من أن النظام هو المتوازنة ، قد ترغب في مراقبة تيك ، والتي سوف تتغير خلال فترة موازنة ، وتحقيق الاستقرار بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في النظام معايرتها ، والشروع في جمع الطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع الطيف ، وإزالة زجاجة عينة عن طريق فتح لأول مرة تجاوز خطوط ناقلة الغاز ، ثم إغلاق الصمامات العينة ، وأخيرا إزالة زجاجة العينة. مطاردة النظام مع الغاز الحامل لمدة 2 -- 4 دقائق ، وإزالة الرطوبة والمواد المتطايرة كثف من خطوط النقل ، والوقاية من عينة إلى عينة المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5،2-5،5 لكل عينة جرثومية ، وجمع أطياف متقطع فارغة إضافية لضمان الطرح فارغة شامل. والطرح فارغة ناقصة تؤدي إلىظهور قمم الخلفية الكيميائية في الطيف الخاص المعالجة التي هي مشتركة بين الغلاف الجوي التأين تقنيات الضغط ، (على سبيل المثال ، الفثالات ، السيليكون ، الخ.) 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند جمع أطياف الخاص ، وضمان أن الإشارات ايون لا تتجاوز حدود الكشف عن وثيقة خطية الخاص ، على النحو الذي يحدده TIC وشدة أقصى الحدود القصوى للفرد. الأيونات يمكن تجاوز حدود العلوي من كشف الصك الخاص توليد قمم القطع الأثرية التي لا ممثل عينتك. </li></ol> 6. ممثل النتائج كمثال على ذلك يمكن للأطياف سيسي - MS التي يمكن الحصول عليها عن المتطايرة البكتيرية ، ووضع بصمات ايون متقلبة إيجابية لE. القولونية وP. الزنجارية نمت هوائيا في لينوكس - LB لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وتظهر (الشكل 2). وهاء ويهيمن طيف القولونية المتقلبة الإندول في 118 = م / ض ، الذي يعطي E. ثقافات القولونية رائحة مميزة لها ، في حين أن الطيف P. الزنجارية يحتوي على أكبر مجموعة متنوعة من قمم protonatable. يرجى ملاحظة أن كثافة نسبية من قمم في الطيف متقلبة تعتمد على المعلمات مفيدة وصفها في القسم 3. يجب أن تكون هذه المعلمات لرقابة مشددة من تجربة إلى تجربة من أجل الحصول على أطياف استنساخه. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2 فارغة ، طرح النمط ايون ايجابية سيسي MS - الأطياف (20 -- 150 م / ض). إ. القولونية K12 و P. الزنجارية PAO1 المتطايرة بعد نمو 24 ساعة الهوائية في لينوكس - LB في 37 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول القمم التي لوحظت في أطياف سيسي ، يرجى الرجوع إلى تشو ، وآخرون 8.

<ol>
	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-line+detection+of+human+skin+vapors.">On-line detection of human skin vapors.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+volatiles+in+breath.">Electrospray ionization of volatiles in breath.</a> Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+fatty+acid+vapors+in+breath+by+electrospray+ionization+and+atmospheric+pressure+ionization-mass+spectrometry.">Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).</li><li>Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+typical+chemical+background+interferences+in+atmospheric+pressure+ionization+liquid+chromatography-mass+spectrometry.">Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).</li><li>Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathogen detection using headspace analysis. , 16-16 (2004).</li><li>Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bacteria+in+vitro+by+mass+spectrometric+fingerprinting:+A+pilot+study.">Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study.</a> Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).</li><li>Schulz, S., Dickschat, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+volatiles:+The+smell+of+small+organisms.">Bacterial volatiles: The smell of small organisms.</a> Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).</li><li>Ligor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+breath+investigation.">Analytical methods for breath investigation.</a> Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).</li><li>Cao, W. Q., Duan, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breath+analysis:+Potential+for+clinical+diagnosis+and+exposure+assessment.">Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment.</a> Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).</li><li>Law, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+complex+viscous+liquids+at+the+molecular+level.">Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+analytes+from+cheese+products+for+fast+detection+using+neutral+desorption+extractive+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).</li><li>Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+organic+compounds+in+foods:+A+five+year+study.">Volatile organic compounds in foods: A five year study.</a> J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).</li><li>Calkins, C. R., Hodgen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+meat+flavor.">A fresh look at meat flavor.</a> Meat Sci. 77, 63-80 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

بكتيريا تنتج مجموعات مختلفة من المواد المتطايرة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا 10-12 و تقييم حالة الأيض. الأسلوب سيسي MS - الموصوفة هنا يوفر وسيلة للتميز بسرعة المتطايرة البكتيرية (في دقيقتين أو أقل) من دون أي تحضير العينة ، وتوليد البكتيريا &quot;بصمة&quot; لتحديد الأنواع. (8) في العقود القليلة الماضية غيرها من الضغط الجوي التأين وقد طبقت تقنيات MS على توصيف مركبات طيارة ، بما في ذلك انتقائية أنبوب تدفق أيون (نخل) ونقل بروتون رد فعل (PTR) مطياف الكتلة. الميزة المميزة التي سيسي يوفر أكثر من هذه الأساليب التأين الأخرى هو أنه من الممكن أن القمم جزء معين (توفير النوع المناسب من مطياف الكتلة تم تكييفها لسيسي) ، الذي هو أداة مهمة لتحديد هوية المركبة. لم نكن معالجة التجزئة الذروة في البروتوكول المذكورة أعلاه ، ولكن للحصول على أمثلة للكيفية التي يمكن أن تستخدم المعلومات التجزئة في توصيف المواد المتطايرة البكتيرية ، يرجى الرجوع إلى تشو ، وآخرون. 8 سيسي - MS والتطبيق المباشر لفي الكشف الموقعي للالتهابات الرئة البكتيرية عن طريق تحليل النفس ، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على أي مكان في العينات التي من الممكن متقلبة. على سبيل المثال ، وتحاليل من المواد المتطايرة في البول والدم ، والتنفس ، والتي هي ذات الصلة لتشخيص الاضطرابات الأيضية ، وتلائم مرض معدي معوي ، والسرطان ، والتعرض لعوامل بيئية ، وسيسي - MS. 13،14 سيسي كما MS - مجموعة واسعة من التطبيقات السريرية غير البصمات المركبات العضوية المتطايرة ، بما في ذلك التحليل السريع للأغذية والمواد المتطايرة مميزة المرتبطة النضج ، والشيخوخة ، أو إفساد. 15-18

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> نوع </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> API - 3000 الثلاثي الرباعي </td><td> صك </td><td> SCIEX </td><td></td><td> شراؤها مع محلل 1.4.2 (النظم البيولوجية التطبيقية) </td></tr><tr><td> سيسي ايون المصدر </td><td> صك </td><td></td><td></td><td> حسب الطلب ، وانظر المرجع 6 </td></tr><tr><td> تدفق الغاز متر </td><td> معدات </td><td> كول - Parmer </td><td> EW - 03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> ثاني أكسيد الكربون </td><td> معدات </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ 99.99 ٪ نقية </td></tr><tr><td> نتروجين </td><td> معدات </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> نقاء عالية جدا </td></tr><tr><td> 100 مل زجاج القناني وسائل الإعلام </td><td> معدات </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> المواضيع المسمار GL45 </td></tr><tr><td> قبعات زجاجة مع منافذ luer </td><td> معدات </td><td> علم الحيوي Fluidics </td><td> 00945T - 3 </td><td> غطاء التجمع </td></tr><tr><td> Luer ميناء المقابس </td><td> معدات </td><td> علم الحيوي Fluidics </td><td> 009LP </td><td> غطاء التجمع </td></tr><tr><td> أنابيب 1 / 4 &quot;(OD) × 1 / 8&quot; (ID) </td><td> معدات </td><td> كول - Parmer </td><td> EW - 95875-02 </td><td> غطاء التجميع وخطوط نقل الغاز </td></tr><tr><td> أنابيب 1 / 8 &quot;(OD) × 1 / 16&quot; (ID) </td><td> معدات </td><td> كول - Parmer </td><td> EW - 06605-27 </td><td> غطاء التجمع </td></tr><tr><td> اتجاهين الصمامات </td><td> معدات </td><td> كول - Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> غطاء التجمع </td></tr><tr><td> التصفية ، الصف آق </td><td> معدات </td><td> مرشحات Balston </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الفورميك ، LC / MS الصف </td><td> الكاشف </td><td> الصياد </td><td> A117 - 05AMP </td><td> Electrospray الحل </td></tr><tr><td> الميثانول ، LC / MS الصف </td><td> الكاشف </td><td> الصياد </td><td> A456 - 500 </td><td> Electrospray الحل </td></tr><tr><td> المياه ، LC / MS الصف </td><td> الكاشف </td><td> الصياد </td><td> W6 - 500 </td><td> Electrospray الحل </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

التأين مطياف الكتلة الثانوية electrospray (سيسي - MS) هو طريقة تم تطويرها للكشف السريع للمركبات طيارة ، من دون الحاجة إلى المعالجة العينة. وكان أول وصف للطريقة التي فين وزملاؤه 1 و تم تطبيقه على الكشف عن المخدرات والمتفجرات غير المشروعة 2 3-4 ، وتوصيف المواد المتطايرة الجلد 5 ، وتحليل النفس 6-7. سيسي التأين يحدث من خلال ردود الفعل نقل بروتون بين الحل وelectrospray الحليلة المتقلبة ، وبالتالي فهي مناسبة لتحليل الجزيئات العضوية مغاير ، كما هو الحال في التأين electrospray التقليدية (ESI). لكن ، خلافا ESI القياسية ، فإن عملية نقل بروتون من سيسي يحدث في مرحلة البخار بدلا من الحل (الشكل 1) ، وبالتالي سيسي هو الانسب للكشف عن المواد المتطايرة العضوية والهباء الجوي. نحن الآن بصدد توسيع استخدام سيسي - MS للكشف عن المواد المتطايرة البكتيرية كوسيلة لتحديد وتوصيف 8 البكتيرية. لقد أظهرنا أنه يمكن استخدام MS - سيسي البصمات متقلبة ، جنبا إلى جنب مع طريقة التحليل الإحصائي ، لتمييز الأجناس البكتيرية ، والأنواع والثقافات المختلطة في مجموعة متنوعة من وسائط النمو. نقدم هنا 8 خطوات للحصول على بصمات الأصابع باستخدام بكتيريا متقلبة سيسي - MS ، بما في ذلك معلمات الفعال الذي يجب أن يكون الأمثل لضمان تحديد البكتيريا قوية والتوصيف.

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS at JoVE.com

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

التأين مطياف الكتلة الثانوية electrospray (سيسي - MS) تمكن من الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة من دون الحاجة إلى أي معالجة مسبقة العينة. هذا البروتوكول يوفر إرشادات لتوصيف (في غضون دقائق) السريع للبكتيريا باستخدام المركبات العضوية المتطايرة سيسي - MS.

تميز باستخدام مواد متطايرة الجرثومي الثانوي قداس الطيف Electrospray التأين (سيسي - MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

characterizing-bacterial-volatiles-using-secondary-electrospray

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.9K Views.  University of Vermont. التأين مطياف الكتلة الثانوية electrospray (سيسي - MS) تمكن من الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة من دون الحاجة إلى أي معالجة مسبقة العينة. هذا البروتوكول يوفر إرشادات لتوصيف (في غضون دقائق) السريع للبكتيريا باستخدام المركبات العضوية المتطايرة سيسي - MS.

Video: Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

عينة استراتيجيات التحضير للتصوير الطيف الكتلي لل3D الثقافة خلية نماذج

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

توصيف نوعي لكسر مائي من الحرارية المائية لتسييل من الطحالب عن طريق 2D اللوني للغاز مع الوقت من الطيران الطيف الكتلي

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

كامل الجسم الطيف الكتلي التصوير من قبل بمساعدة مصفوفة الأشعة تحت الحمراء ليزر الامتزاز Electrospray التأين (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...