وقدمت جيم ايليجانس الجينات المحورة من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة (جامعة مينيسوتا ، مينيابوليس ، مينيسوتا). وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS0667678 R21 - 01 إلى KS. وشارك جميع المؤلفين في مجال جمع وتحليل وتفسير البيانات. شارك CKL ، KS ، ومؤسسة البترول الكويتية في كتابة وتنقيح المخطوطات.

1. إعداد الطعام دودة البكتيرية اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من E. المشبعة القولونية مل مرق OP50 ثقافة البكتيرية إلى 500 رائع تستكمل مع الستربتوميسين ميكروغرام / مل 50 و تنمو في حاضنة تهتز (225 دورة في الدقيقة) ليلا 37 درجة مئوية. </li></ol> اليوم 2 <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام بين عشية وضحاها ثقافة البكتيرية في أنابيب ten 50 مل والبكتيريا الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي المبردة في RCF 2500 لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب مرق قبالة LB وresuspend كل بيليه الجرثومي في 10 مل من السائل وسائط النمو الخيطية (NGM). هزة أفقيا في الكلمة شاكر لمدة 15 دقيقة لresuspend البكتيريا. لجعل NGM العازلة ، إضافة 3 غرام كلوريد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات وL 1 الأوتوكلاف. تبرد إلى 55 درجة مئوية وإضافة في النظام العقيم الحلول التالية : 1 مل من CaCl M 1 2 ، 1 مل من MgSO M 1 4 ، و 25 مل من 1 فوسفات البوتاسيوم M ، 6.0 درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في جهاز للطرد المركزي المبردة في RCF 2500 لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب قبالة العازلة NGM وتزن بيليه البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من المخزن إلى NGM resuspend الكريات ، قسامة 3 مل من تركيز البكتيريا إلى 15 مل الأنابيب ، وتخزين في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. على نطاق واسع C. ايليجانس ثقافة السائل نستخدم خط VP596 المعدلة وراثيا (dvIs19 [pAF15 (GST - 4 : : GFP : NLS)] ؛ vsIs33 [DOP - 3 : : RFP]) تقل اثنين من بنيات فلوري : Pgst -4 : 14 GFP لرصد SKN - 1 النشاط وPDOP 3 : 17 RFP لتكون بمثابة معيار للتطبيع عدد دودة. اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 150 مل NGM العازلة ، 1.5 مل مرق LB ، 150 ميكرولتر من الكولسترول ملغم / 5 مل (في الإيثانول) ، و 75 ميكرولتر من الستربتوميسين ملغ / 100 مل. فلتر تعقيم الخليط ويضاف إلى قارورة معقمة 1 ليتر. ملاحظة : إضافة 1 ٪ لمرق LB العازلة NGM يساعد على منع الديدان من الالتصاق على الأواني الزجاجية وبلستيكور ، ولكن هذا المبلغ لا يكفي لدعم نمو البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزامن مع الديدان الإجراء هيبوكلوريت معيار 18. يمكن معالجة ما يصل إلى 0.5 مل من الديدان حامل في أنبوب واحد مل 15 مع 5 مل من محلول هيبوكلوريت (3.75 مل من الماء المعقم ، 1 مل التبييض المنزلية ، و 250 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 10 N). غسل البيض إصداره مع الماء المعقم وresuspend منها في 10 مل من NGM العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع عينة من 100 أضعاف البيض في NGM عازلة (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر في 10 مل) ، وحساب عدد البيض في ثلاث aliquots 5 ميكرولتر منفصلة. متعددة متوسط ​​عدد 200000 (100 × معامل التخفيف 2000) لتقدير العدد الكلي للبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200000 إلى 2 مليون بيضة في قارورة مع NGM العازلة وتهز الثقافة عند 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية. </li></ol> اليوم 2 <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يقل عن 16 ساعة بعد إضافة البيض إلى القارورة ، واستخدام الماصة العقيمة المصلية لإزالة ما يقرب من 0.5 مل من ثقافة دودة مع وقف التنفيذ. الماصة three 5 قطرات ميكرولتر على غطاء العقيمة طبق بيتري. وضع غطاء في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 1-2 دقائق على شل الديدان. حساب متوسط ​​عدد الديدان تعيش مظلل بنسبة 5 ميكرولتر ثم متعددة 30000 (150 مل / 5 ميكرولتر) لتقدير العدد الكلي للديدان تفقس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد أنبوب للثقافة OP50 المجمدة البكتيرية (البروتوكول 1.6) وإضافة 3 مل من 50 ٪ في الثقافة OP50 دودة لكل 500،000 الديدان مظلل. هز قارورة في 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية. وسوف تتطور الى الديدان L4 يرقات وصغار البالغين في 51 ساعة تقريبا. ينبغي أن يكون من البكتيريا OD600 عن 2.200 في البداية. رصد كمية البكتيريا التي الامتصاصية وإضافة المزيد إذا OD 600 تنخفض 0.900. </li></ol> 3. جمع الدودة والاستغناء اليوم 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة العقيمة المصلية لنقل حوالي 0.5 مل من ثقافة دودة علقت لوحة NGM آغار القياسية. عرض الديدان مع stereomicroscope للتأكد من أن معظمها L4 اليرقات أو صغار البالغين. سوف L4 اليرقات بقعة بطني واضحة في منتصف الجسم. وسوف يكون الشباب أكبر قليلا ، ولن يكون له بقعة واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ثقافة دودة في أنابيب معقمة 50 ملم ووضع الأنابيب في أنبوب اختبار رف على الفوق. السماح للديدان لتسوية لمدة 10 دقائق تقريبا. إزالة طاف بواسطة الشفط أو pipetting. ملاحظة : هذه الخطوة يمكن أن تكون هامة لإزالة بيض لم يفقس أو الديدان التي لم تتطور لأنها سوف تستقر L4 أبطأ من يرقات وصغار البالغين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل الديدان في أنبوب واحد 50 مل وتغسل مع NGM العازلة مع مرق LB 1 ٪ (NGM + LB) 3-4 مرات لإزالة البكتيريا. ملاحظة : يتم ذلك على أفضل وجه في جهاز للطرد المركزي الدلو المتأرجح من خلال جمع الديدان في 500 RCF لمدة 30 ثانية ، واستبدال طاف مع NGM الطازجة + LB العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، وملء الأنبوب مع NGM إلى 50 مل + LB العازلة وتصب في قارورة دودة مخصصة صرفها. إضافة شريط صغير يحرك ويحرك للحفاظ على الديدان مع وقف التنفيذ. العد اله عدد من الديدان في ثلاث قطرات 5 ميكرولتر كما هو مبين أعلاه. تمييع مع LB + NGM حتى تحصل 12-15 الديدان انخفاض بنسبة 5 ميكرولتر (~ 2،5-3،0 الديدان / ميكرولتر). ملاحظة : هناك حاجة إلى الحد الأدنى من حوالي 20 مل (60000 الديدان) لملء الفراغ القتلى من قارورة والاستغناء عن موزع الكاسيت. كل لوحة بشكل جيد يتطلب حوالي 384 35000 الديدان أو 11.5 مل من الديدان مع وقف التنفيذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر الاستغناء الكاسيت وتعقيم بواسطة فتيلة مع الايثانول 70 ٪. شطف خارج الايثانول بحلول فتيلة مع الماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج نهاية الكاسيت صرفها في قارورة بحيث انها مجرد اثارة فوق العارضة دون تعطيل حركتها. تأكد من أن تظل معلقة في جميع أنحاء الديدان القارورة كلها. برنامج موزع على الاستغناء على سرعة منخفضة مع البقول قبل 2. رئيس وتشغيل ما لا يقل عن 10 مل من الديدان مع وقف التنفيذ. ملء صفائح بسرعة عند الحاجة لمنع الديدان من الاستقرار في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الشريط مع لوحات للتنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات على منصة تهتز في حاضنة على درجة حرارة مناسبة للفحص الخاص بك. لا مكدس على لوحات. </li></ol> 4. تحليل مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان المستهدف في لوحة قارئ microplate لقياس كثافة مضان كل جيدا مع الطول الموجي من الانبعاثات والإثارة المناسبة (فلاتر لمقايسة لدينا : GFP 485/20ex 528/20em ؛ RFP 540/25ex 590/35em). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة GFP / RFP وتطبيع مع قراءات من آبار المراقبة (بدون تفعيل المجمع) لتحديد الفرق الدقيق أضعاف كثافة مضان المستمدة من علاجات فردية. </li></ol> 5. ممثل النتائج : لدينا SKN - 1 مقايسة يستخدم متكامل صبغويا سلالة مراسل المزدوجة (VP596). كما هو مبين في الشكل 1 ، ويرتبط أيضا بعدد من الديدان إلى حجم الاستغناء. كما هو مبين في الأرقام 2A و 2B ، GFP الكلي ومضان RFP لكل بئر هو تكرار للغاية من جانب إلى جانب لوحة 384 في جميع أنحاء جيدا. كما هو مبين في الشكل 2C ، والأمم المتحدة التي يسببها Pgst - 4 : : يرتبط خطيا GFP لمضان PDOP - 3 : : RFP عبر 384 بئرا. عندما أعرب عن كنسبة من GFP / RFP ، مضان يصبح استنساخه للغاية من جانب إلى جانب لوحة 384 في جميع أنحاء جيدا (قارن معامل الاختلاف من 2D إلى الشكل 2A) مما يدل على قدرة PDOP - 3 : : RFP مراسل للحد من التقلبات. كما هو مبين في الشكل 3 ، وتحريض النسبية GFP لRFP مع SKN - 1 تفعيل أجنبي بيولوجيا (38 جغلون ميكرومتر) قوي للغاية وقابلة للتكرار عبر 384 لوحة جيدا. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الاستغناء عن الرقم 1. عدد الديدان مقابل وحدة التخزين. وكانت مخففة الديدان 2/μl تقريبا والى الاستغناء عن 24 لوحة العد اليدوي جيدا لمع stereomicroscope. N = 8 آبار في وحدة التخزين. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. مضان المجموع من الديدان إلى الاستغناء عن 384 لوحة وكذلك استنساخه. وكانت مخففة الديدان ميكرولتر 2.5/μl تقريبا و 30 والاستغناء تماما في كل لوحة 384 أيضا. وكان GFP (A) وطلب تقديم العروض (B) مضان جميع الآبار معامل التباين أقل من 9 ٪. (C) يرتبط ارتباطا عاليا GFP مضان لمضان RFP. (د) حساب نسبة GFP RFP لخفض معامل الاختلاف إلى أقل من 6 ٪ (A ، B ، D و) خطوط الصلبة تشير وسائل وخطوط كسر تحديد ثلاث الانحرافات المعيارية أعلى أو أدنى من المتوسط. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> . الشكل 3 تفعيل Pgst - 4 : : GFP قوي وثابت. تم فيها الاستغناء عن حوالي 75 L4 الديدان في جميع الآبار من 384 لوحة جيدا و 38 ميكرومتر جغلون أضيف في كل عمود آخر. وقد تم قياس GFP ومضان RFP بعد 21 ساعة من الحضانة. يتم وضع علامة على نسب يعني مضان السيطرة النسبية للجميع (1.0) وجغلون الآبار (8.9) مع الخطوط الصلبة. ثلاثة انحرافات معيارية فوق وتحت السيطرة يعني يعني جغلون يتم وضع علامة مع خطوط مقطوعة.

<ol>
	<li>Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-throughput+screen+identifies+inhibitors+of+the+Schistosoma+mansoni+redox+cascade.">Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade.</a> PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).</li><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+small+animal+models,+where+are+we.">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li><li>Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+versatile+platform+for+drug+discovery.">Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery.</a> Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).</li><li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response.">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).</li><li>Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD40+repeat+protein+WDR-23+functions+with+the+CUL4/DDB1+ubiquitin+ligase+to+regulate+nuclear+abundance+and+activity+of+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans.">The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide-responsive+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).</li><li>Tullet, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+inhibition+of+the+longevity-promoting+factor+SKN-1+by+insulin-like+signaling+in+C.+elegans.">Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans.</a> Cell. 132, 1025-1038 (2008).</li><li>Oliveira, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-adapted+stress+and+longevity+gene+regulation+by+Caenorhabditis+elegans+SKN-1/Nrf.">Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf.</a> Aging Cell. , (2009).</li><li>Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1.">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8, 258-269 (2009).</li><li>Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+chemoprevention+mechanisms+mediated+through+the+Keap1-Nrf2+pathway.">Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway.</a> Antioxid Redox Signal. , (2010).</li><li>Kwak, M. K., Kensler, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+NRF2+signaling+for+cancer+chemoprevention.">Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).</li><li>Leiser, S. F., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+signaling,+a+mechanism+for+cellular+stress+resistance+in+long-lived+mice.">Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice.</a> Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).</li><li>Link, C. D., Johnson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+transgenes+for+study+of+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).</li><li>Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1/Nrf2+inhibits+dopamine+neuron+degeneration+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+methylmercury+toxicity.">SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity.</a> Toxicol Sci. , (2010).</li><li>Hasegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+inexpensive+method+to+screen+for+common+foods+that+reduce+the+action+of+acrylamide,+a+harmful+substance+in+food.">A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food.</a> Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).</li><li>Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+extrasynaptic+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).</li><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans, a Practical Guide. , (2005).</li><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم طريقة لزراعة وتوزيع أعداد كبيرة من الديدان الخيطية جينيا. والمعدات المستخدمة لزراعة الديدان هو المعيار لأداء مختبرات الاستنساخ الجزيئي وسائل ومعدات مناولة الاستشعاع معيارية للمختبرات معالجة أعداد كبيرة من microplates. الأساليب الأخرى الاستغناء أعداد كبيرة من يعي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> LB مرق </td><td> منتجات شركة البحوث الدولية </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> رائع مرق </td><td> منتجات شركة البحوث الدولية </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> التآزر ™ HT موضوع وضع القارئ Microplate </td><td> BioTek </td><td></td><td> مرشحات : GFP 485/20ex 528/20em ؛ RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> حدد مصدر MicroFlo </td><td> BioTek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> قارورة دودة الاستغناء </td><td> جنوب العلمية المحدودة ، Micanopy ، FL </td><td></td><td> مخصص تجميعها (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplates </td><td> غرينر بيو واحد </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> تنفس ختم الشريط </td><td> نونك </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5 - P - هيدروكسي naphthoqinone) جغلون </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> يذوب في جغلون DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D - 5879 </td><td></td></tr><tr><td> جيم ايليجانس سلالة معدلة وراثيا </td><td> البلاغ المختبري </td><td> VP596 </td><td> Pgst - 4 : : GFP وPDOP 3 : : RFP </td></tr></tbody></table>

high-throughput screening and biosensing with fluorescent c. elegans strains

الفرز الفائق الإنتاجية (HTS) هو طريقة فعالة لتحديد جهري من العمليات البيولوجية الكيميائية. ومع ذلك ، غالبا ما توجد العديد من المركبات التي تم تحديدها في شاشات باستخدام نماذج ثقافة الخلية لتكون سامة أو غير نشط في الجسم الحي عقاقيري 1-2. يمكن الفرز في النماذج الحيوانية كلها تساعد على تجنب هذه المزالق وتبسيط مسار التنمية المخدرات. ايليجانس جيم هو كائن نموذج متعددة الخلايا مناسبة تماما للHTS. انها صغيرة (&lt;1 مم) ويمكن الاستغناء اقتصاديا وتربيتها في السوائل. جيم ايليجانس هي أيضا واحدة من أكثر النماذج الحيوانية الانقياد تجريبيا يتيح التعرف السريع والمفصل لوضع المخدرات مقابل عمل 3. وصفنا بروتوكول للزراعة وصرفها من سلالات الفلورسنت C. ايليجانس الإنتاجية العالية لفحص المكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية التي تغير التعبير عن جينة معينة. تزرع أعداد كبيرة من الديدان متزامنة تنمويا في الثقافة السائل ، وحصادها ، وغسلها ، وعلقت في مناطق ذات كثافة المعرفة. ثم تضاف الديدان إلى الأسود ، لوحات 384 جيدا مسطحة باستخدام موزع تحوي السائل. يمكن إضافة جزيئات صغيرة من مكتبة الكيميائية أو عينات الاختبار (على سبيل المثال ، الماء ، الغذاء ، أو التربة) من الآبار مع الديدان في الجسم الحي ، ويقاس في الوقت الحقيقي مع كثافة مضان قارئ microplate مضان. ويمكن تكييف هذه الطريقة على أي الجينات محرض في C. ايليجانس التي مراسل مناسبة متاحة. وتعرف جيدا العديد من الإجهاد محرض والمسارات التنموية في الترانسكربتي C. ايليجانس والسلالات المعدلة وراثيا GFP مراسل موجودة بالفعل بالنسبة للكثيرين منهم 4. عندما يقترن المعدلة وراثيا للصحفيين ان المناسبة ، يمكن استخدام أسلوب لدينا للكشف عن جهري ممرا أو المقايسات لتطوير جهاز الاستشعار البيولوجي قوية للملوثات البيئية. نحن لدينا تثبت C. ايليجانس الثقافة والاستغناء عن بروتوكول مع مقايسة HTS ضعنا لرصد C. &#39;ن&#39; ايليجانس قبعة عامل النسخ طوق SKN - 1. SKN - 1 و Nrf2 لها نديد الثدييات تنشيط الجينات cytoprotective خلال الاكسدة وأجنبي بيولوجيا 5-10. Nrf2 الثدييات يحمي من الاضطرابات المتعلقة بالعمر عديدة مثل السرطان ، وتنكس عصبي ، والتهاب مزمن ، وأصبح هدفا رئيسيا الكيميائي 11-13. يستند على فحص لدينا مراسل GFP المعدلة وراثيا لSKN - 1 هدف الجينات GST -4 14 الذي يشفر 6 - S ترانسفيراز الجلوتاثيون. مراسل GST -4 هو أيضا جهاز الاستشعار البيولوجي للمواد الكيميائية وأجنبي بيولوجيا الاكسدة التي تنشط SKN - 1 ، ويمكن استخدامها للكشف عن مستويات منخفضة من الملوثات ، مثل الأكريلاميد وميثيل الزئبق 15-16.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains at JoVE.com

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

إجراءات لبناء زراعة السائل وصرف<em&gt; C. ايليجانس</emيوصف&gt; سلالات معربا عن البروتينات مراسل الفلورسنت التي لا تتطلب معدات باهظة الثمن الفرز. ويمكن تطبيق هذا النهج في العديد من محرض<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الجينات لاكتشاف المخدرات أو biosensing من الملوثات.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

high-throughput-screening-biosensing-with-fluorescent-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

17.9K Views.  University of Florida. إجراءات لبناء زراعة السائل وصرف C. ايليجانس سلالات معربا عن البروتينات مراسل الفلورسنت التي لا تتطلب معدات باهظة الثمن الفرز. ويمكن تطبيق هذا النهج في العديد من محرض C. ايليجانس الجينات لاكتشاف المخدرات أو biosensing من الملوثات.

Video: High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس

الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة