وقد تم تمويل هذا العمل من خلال برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم البيئية جينوم (رقم المنحة EF - 0723707).

1. خلية الميكروبية الاستخراج : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الحصير الميكروبية مع مدقة العقيمة طحن عن طريق خلط دقيق. مكان تقريبا كل 30 غراما (وزن رطب) من المادة حصيرة المتجانس في حاوية معقمة من خلاط وارنج ، إضافة حوالي 100 مل من كلوريد الصوديوم M 1 (أو تركيز محدد على العينة في الاستخدام) ، ومزيج ثلاث مرات على سرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة مع متقطعة التبريد في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. نقل الطين في زجاجة 250 مل الطرد المركزي وملء ما تبقى فارغة مع حجم كلوريد الصوديوم M 1. يعد حل كلوريد الصوديوم في المياه وتعقيمها DI تصفية تعقيم عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد مزيد من الخلايا الميكروبية من المصفوفة التي تهز (150 دورة في الدقيقة) باستخدام vortexer (دوامة R - الجني 2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (500x غ) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل بلطف طاف في قارورة مع الحد الأدنى من الاضطرابات الرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مكعبات الرواسب ، كرر الخطوات ومزج 1.2 و 1.3 أربع مرات إضافية ، مع إضافة جديدة لكلوريد الصوديوم بيليه كل الرواسب في نهاية الخطوة 1.3. يتم نقل كل من طاف استخراج كلوريد الصوديوم في قارورة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين supernatants من إخراج السجناء من الزنازين (5) وأجهزة الطرد المركزي في aliquots من 200 مل بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف ، resuspend بيليه كل خلية في 10 مل من فوسفات الصوديوم 2 ٪ ، والجمع بين الكريات ويشكلون وحدة التخزين إلى 200 مل مع فوسفات الصوديوم 2 ٪. غسل الخلايا تهتز (150 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية هذه الخطوة يجب أن يكون إلا أنبوب واحد من الخلايا للبدء في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل ، resuspend طاف بيليه الخلية في 200 مل من TE (50 ملي EDTA) ، وغسل الخلايا تهتز (150 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، resuspend في TE 15 مليلتر (10 ملي EDTA) ، وتخزين 200 ميكرولتر aliquots -80 درجة مئوية في حين الحاجة لإخراج الحمض النووي. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي وتنقية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر 200 M كلوريد الصوديوم ، و 200 ميكرولتر SDS 10 ٪ ، و 100 ميكرولتر M - 14.3 β المركابتويثانول إلى الخلية الميكروبية قسامة 200 ميكرولتر. المزيج بلطف 4-6 مرات عكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخضع هذا المزيج على 3 جولات من ذوبان للتجمد التي تغمر في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة تليها ذوبان في الماء 65 درجة مئوية حمام لمدة 5 دقائق. تمديد النهائي لذوبان 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 M 5 ميكرولتر البوتاسيوم خلات (الرقم الهيدروجيني 5.5) ومكان على الجليد لمدة 10 دقيقة. الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وطاف لنقل أنبوب جديد باستخدام ماصة الحافة واسعة الجوف. إضافة 3 ميكرولتر من ريبونوكلياز ألف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من كلوروفورم ، يهز لفترة وجيزة قبل انقلاب ، والطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الطبقة العليا من طاف في أنبوب جديد باستخدام ماصة الحافة واسعة الجوف. تجنب pipetting طبقة واجهة بيضاء تقع بين الطبقات العليا والسفلى. كرر الإجراء كلوروفورم الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من المبرد (في -20 درجة مئوية) الأيزوبروبانول إلى احتضان وطاف على الجليد لمدة 30 دقيقة إلى الحمض النووي يعجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى (20800 XG) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية لتكوير الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بيليه وغسل الحمض النووي مع 1 مل من المبرد (في -20 درجة مئوية) الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى (20800 XG) لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وتكرار غسل الايثانول 70 ٪ ، والهواء الجاف بيليه الحمض النووي لمدة 10 دقيقة. تكرار غسل 70 ٪ الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الحمض النووي في 25 ميكرولتر TE (10 ملي EDTA) ، دافئة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والجمع في أنبوب واحد إذا تم استخدام أنابيب متعددة ، والماكياج الحجم إلى 500 ميكرولتر مع الشركة المصرية للاتصالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر الجليد الباردة (أو على 4 درجات مئوية) 20 ٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) (أعد في كلوريد الصوديوم 1.2 متر). المزيج بلطف بواسطة انقلاب ، يحضن على الجليد لمدة 10 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إلى الحمض النووي بيليه. إزالة والتخلص من طاف ويغسل DNA مكعبات مع 1 مل من الايثانول 70 ٪ المبردة ، والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة ، وresuspend في 30-50 TE ميكرولتر أو الماء الصف الجزيئية. تسهيل إعادة تعليق من الحمض النووي عن الاحترار عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والحمض النووي في مخزن -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. الطهارة الحمض النووي ، وتركيز وتحديد الحجم : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نوعية الحمض النووي عن طريق قياس 260 / 280 ألف وألف نسب 260/230 باستخدام Nanodrop 1000 معمل أو أي أجهزة أخرى ملائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا المعلومات كوانت dsDNA طقم الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم الحمض النووي باستخدام الجل الكهربائي نبض الميدان. وشملت تبديل مرة الأولي من 0.35 ثانية ، وقت التبديل النهائي من 7.67 ثانية ، وزاوية 120 درجة عن التدرج من 6.0 V / سم عند وإعداد 1 ٪ agarose هلام مع 0.5X TBE واستخدام المعلمات التالية على نظام معين CHEF XA خطية صamping عامل. وصمة عار مع هلام 1 × أنا SYBR الخضراء لمدة 30 دقيقة. تحميل الحمض النووي بين 700-1000 مجموع نانوغرام على هلام. انظر الشكل. 3 للشكل مكثف للبروتوكول كاملة. </li></ol> ممثل النتائج : استخراج الخلايا : وأظهرت مقتطفات متتابعة الخلية الجرثومية (supernatants) أن تعكر مقتطفات تتناقص مع زيادة عدد عمليات الاستخراج. هذا يشير إلى انخفاض في عدد الخلايا التالية استخراج كل خلية المتعاقبة. المهم أن نلاحظ هنا أنه مع كل خطوة إضافية استخراج الخلايا يتيح الفرصة لإدخال المواد الملوثة ، وينبغي التقليل من عدد من الخلايا بحيث قلع النهائي بيليه الخلية هو ممثل المجتمع الميكروبي بشكل عام. وكانت تسيطر غيرها من مصادر التلوث من خلال اعتماد تقنيات مختبرية كافية العقيمة. على سبيل المثال ، تم إعداد الحلول في مجال المياه وتعقيمها تعقيم DI التصفية. وتعقيم الحاويات مع الكحول ، وتعقيمها ، ومعالجتها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية crosslinker. تركيز الحمض النووي وتحديد النوعية : أسفرت بروتوكول حوالي 2 ميكروغرام من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) (الشكل رقم 4) لكل غرام من العينة حصيرة مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6 ، وهناك نسبة 0.7 260/230 (الجدول 1). على الرغم من أن يبدو أن هناك نسبة 260/230 أن تكون منخفضة ، لا تثبيط تطبيق الجزيئية المستندة المصب مثل PCR - 16S التضخيم من جينات الرنا الريباسي وحظ في دراسة منفصلة 7. ومن المهم أن نلاحظ أن الحمض النووي من الحصير الملوحة اثنين من المصادر الرئيسية للتلوث ؛ EPS والأملاح. ولذلك فمن الممكن أن آثار هذه الملوثات قد يكون هناك تأثير على نسب 260/230 على الرغم من الجهود الهائلة للحد من آثارها على تطبيقات تيار باستمرار. تقرير حجم الحمض النووي : نبض الحقل الكهربائي للهلام توظف تدفق النابض الحالية مع تبديل الاتجاه متقطعة مما أدى إلى تشويه الحمض النووي كما هو مبين في الشكل 3. أسفرت بروتوكول لدينا الحمض النووي HMW حوالي 35-50 كيلو بايت. في حين أن بعض حجم الحمض النووي قد يكون أصغر من 30 كيلوبايت ، فمن المهم أن يكون جزءا من مسحة فوق 35 كيلو بايت نظرا إلى أن الاستنساخ fosmid يتطلب ~ 40 كيلو بايت إدراج الحمض النووي DNA وشظايا أكبر توفير قدر أكبر من الوصول إلى مسارات السكروز سليمة. في دراستنا ، وقد اقتطعت مسحة الحمض النووي فوق 35 كيلو بايت وتنقيته من أجل استنساخ ناقلات كبيرة تضاف الجزيئية وتطبيقات أخرى. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الرقم الجرثومية الشديدة الملوحة 1. حصيرة موقع أخذ العينات (البركة الكبيرة) الموجود على إلوثيرا ، وجزر البهاما. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. والمقطع العرضي للحصيرة الجرثومية الشديدة الملوحة المستخدمة في هذه الدراسة. تم الحصول على حصيرة الميكروبية من بركة تقع على إلوثيرا الملوحة ، وجزر البهاما. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. تمثيل تخطيطي لإجراءات المشاركة في استخراج الخلايا الجرثومية ، وتحلل الخلية ، واستخراج وتنقية الحمض النووي metagenomic. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الجزيئية توصيف الحمض النووي المستخرج من الوزن باستخدام النبض الكهربائي للهلام الميدان. حارة M هي علامة HMW ، والممرات 1 و 2 من الحمض النووي يتطابق metagenomic المستخرجة من حصيرة الملوحة إلوثيرا باستخدام بروتوكول أعلاه. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> استخراج أسلوب </td><td></td><td> تركيز نانوغرام / غ </td><td> A 260/280 </td><td> A 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> مندوب 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> مندوب 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. استخراج قياس تركيز ونوعية الحمض النووي من حصيرة الملوحة الميكروبية.

<ol>
	<li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms+in+intertidal+systems:+an+overview.">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li><li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats.">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li><li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments.">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li><li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials.">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li><li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples.">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li><li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis.">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li><li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats.">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li><li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+does+matter:+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics.">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology &#38; Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li><li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+the+Soil+Metagenomic:+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms.">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li><li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Rhodopsin:+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea.">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نظرا إلى أن مجموع إزالة الخلية من المعقدة والمتنوعة للغاية العينات الجرثومية حصيرة ليس عمليا ، فإن القلق الأساسي هو مدى الخلايا المستخرجة تمثل حصيرة الميكروبية الشاملة المجتمع. في دراسة سابقة ، أظهرت PCR - DGGE تحليل الجينات الميكروبية 16S الرنا الريباسي أن إزالة الخلاي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20 ٪ من كلوريد الصوديوم 1.2 M </td></tr><tr><td> أسيتات البوتاسيوم </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td> فيشر العلمية </td></tr><tr><td> كوانت - IT طقم الفحص dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> BDH كيماويات </td><td> BDH8014 </td><td> اضرب المناسبة. </td></tr><tr><td> سلفات الصوديوم دوديسيل </td><td> فيشر العلمية </td><td> 03-500-509 </td><td> 10 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم </td><td> EMD كيماويات </td><td> SX0583 - 3 </td><td> 2 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> TBE </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP1333 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF مخطط نظام XA </td><td> راد مختبرات بيولوجية </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> معمل NanoDrop 1000 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> ND - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> العلمي للصناعات المحدودة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> وارنج خلاط </td><td> وارنج المختبر </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of high molecular weight dna from microbial mats

تحليل ناجحة ودقيقة ، وتفسير البيانات metagenomic يعتمد على استخراج كفاءة عالية الجودة ، وارتفاع الوزن الجزيئي المجتمع الحمض النووي (HMW). ومع ذلك ، والعينات البيئية تشكل حصيرة غالبا ما يواجهون صعوبات في الحصول على تجمعات كبيرة عالية الجودة HMW الحمض النووي. الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة تحتوي على كميات عالية من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) (1) والأملاح التي قد تمنع التطبيقات المصب من الحمض النووي المستخرج. وغالبا ما تستخدم أساليب مباشرة وقاسية في استخراج الحمض النووي من عينات الحرارية. وعادة ما تستخدم هذه الأساليب لأن العائد على السهم في الفرش ، ومصفوفة لاصقة ، تربط الحمض النووي 2،3 أثناء تحلل المباشر. نتيجة لأساليب أشد قسوة الاستخراج ، والحمض النووي أصبحت مجزأة إلى أحجام صغيرة 4،5،6. الحمض النووي وهكذا يصبح مناسبة لاستنساخ ناقلات كبيرة إدراج. من أجل الالتفاف على هذه القيود ، ونحن التقرير منهجية محسنة لاستخراج الحمض النووي HMW من نوعية جيدة وكمية من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. استخدمنا أسلوب غير المباشرة التي تنطوي على فصل الخلايا الميكروبية من الخلفية مصفوفة حصيرة من خلال المزج والطرد المركزي المغاير. وكان استخدام مجموعة من الإجراءات الميكانيكية والكيميائية لاستخلاص وتنقية من الحمض النووي للخلايا الجرثومية المستخرجة. بروتوكول لدينا ما يقرب من 2 ميكروغرام الغلة من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) في كل غرام من العينة حصيرة ، مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6. وعلاوة على ذلك ، والتضخيم من جينات الرنا الريباسي 16S 7 تشير إلى أن البروتوكول هو قادر على تقليل أو القضاء على أي آثار المثبطة من الملوثات. نتائجنا توفر منهجية ملائمة لاستخراج الحمض النووي من الحصير HMW الميكروبية للدراسات الفنية وmetagenomic يمكن أن تنطبق على غيرها من العينات البيئية التي استخراج الحمض النووي هو التحدي.

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats at JoVE.com

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

نحن نقدم بروتوكول محسنة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. يتم فصل الخلايا الميكروبية من مصفوفة حصيرة قبل استخراج الحمض النووي وتنقيتها. هذا من شأنه أن يعزز تركيز ، والجودة ، وحجم الحمض النووي. ويمكن استخدام بروتوكول الحرارية للعينات أخرى.

استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  Arnold School of Public Health, University of South Carolina. نحن نقدم بروتوكول محسنة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. يتم فصل الخلايا الميكروبية من مصفوفة حصيرة قبل استخراج الحمض النووي وتنقيتها. هذا من شأنه أن يعزز تركيز ، والجودة ، وحجم الحمض النووي. ويمكن استخدام بروتوكول...

Video: Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Biology of Microbial Communities  - Interview

بيولوجيا المجتمعات الميكروبية -- مقابلة

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been treated with storage/lysis buffer and archived at -80&deg;C, and to purify this DNA using a cesium chloride density gradient.  The protocol begins with two one-hour incubation steps to liberate DNA from cells and remove RNA.  Next, a series of Phenol:Chloroform and Chloroform extractions are performed followed by centrifugation to remove proteins and cell membrane components, collection of the aqueous DNA extract, and several buffer exchange steps to wash and concentrate the extract.  Part Five describes the optional purification via cesium chloride density gradient.  It is recommended to work with less than 15 samples at one time to avoid confusion and cut down protocol time. The total time required for this protocol depends on the number of samples to be extracted. For 10-15 samples and assuming the proper centrifugation equipment is available, this entire protocol should take 3 days. Make sure you have the hybridization ovens set to temperature at the outset of the process.

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

We describe a method for extraction of high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;m Sterivex filters, followed by cesium chloride density gradient centrifugation for purification.

استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر Sterivex فلاتر والسيزيوم كلوريد التدرج الكثافة الطرد المركزي

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

الميوسين الاغاروز جل الكهربائي: ويسترن التنشيف للبروتينات سكرية عالية الوزن الجزيئي


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

إعداد النوى الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لكلا RNA واستخراج الحمض النووي

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

استخراج على نطاق صغير من Caenorhabditis elegans الحمض النووي الجينومي

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...