وقد تم تمويل هذا العمل بواسطة منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (منح عدد MCB - 0447750).

<ol>
	<li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+(Ice-Cap+2.0).">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li><li>Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis.">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li><li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era.">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li><li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis.">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li><li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration.">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li><li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis.">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iTILLING:+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis.">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li><li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING:+practical+single-nucleotide+mutation+discovery.">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li><li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics.">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li><li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+(TILLING)+for+plant+functional+genomics.">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب آيس كاب المعروضة هنا تمكن أحد العلماء لجمع عينات الأنسجة من مئات ، بل آلاف ، من النباتات الفردية في يوم واحد واستخراج الحمض النووي الجيني بكفاءة من تلك العينات لاستخدامها في التفاعلات التنميط الجيني. عالم من خلال إعطاء الفرد القدرة على التركيب الوراثي آلاف شتلة في فترة قصيرة من الزمن ، وطريقة الآيس كاب لديه القدرة على تيسير عدد من التجارب الجينية التي لن يكون الأمر خلاف ذلك لتنفيذ العملية. وتقدم العديد من الأمثلة أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم الخرائط الجينية. يمكن التعجيل غرامة النطاق رسم الخرائط الجينية إذا كان الباحث غير قادرة على تحديد الأحداث التوحد ضمن فاصل زمني محدد على طول الكروموسوم 3. إذا كان هذا الفاصل الزمني ينطوي على بعد مسافة قصيرة جدا الجينية ، فإن الأحداث التي وقعت تأشب تكون نادرة نسبيا في فصل السكان الخرائط. لهذا السبب ، قد يكون من الضروري آلاف شاشة النباتات الفردية للعثور على إعادة المرجوةcombinant الأفراد. ويمكن تسريع هذه العملية إلى حد كبير من خلال استخدام كاب الجليد. حتى في عصر الجينوم على نطاق التسلسل من جديد ، فإنه لا يزال من الضروري أن تظهر مباشرة طفرة معينة هي المسؤولة مباشرة عن النمط الظاهري في المصالح. في هذه الحالات ، سوف يكون من الضروري التفريق بين طفرة الاهتمام بعيدا عن غيرها من الطفرات ترتبط ارتباطا وثيقا من أجل إثبات وجود طفرة مرشح هو في الواقع المسبب للمرض. في هذه الحالات ، فإن الآيس كاب توفير وسيلة فعالة لكسر الربط بين زوج من طفرات مرتبطة بإحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متعدد المسوخ. لقد أصبح من الشائع بالنسبة للباحثين الذين يدرسون Arabidopsis الجمع بين الأليلات الطافرة من مواضع عدة متميزة في فرد واحد من أجل التغلب على التكرار وظيفية 4-6. كمثال على ذلك ، والنظر في الحالة التي يكون فيها أحد يرغب في الجمع بين الأليلات الطافرة من أربعة مواضع مختلفة في مصنع واحد من خلال معبر الوراثية. لهذا المشروع ، وسوف يكون من الضروري إنشاءن الفرد هو متخالف في هذه مواضع الأربعة جزء من خطة العبور. عندما تكون هذه البذور مجموعات رباعية ، متغايرة ، من المتوقع أن زيجوت متماثلة الألائل الرباعي أن يكون حاضرا في معدل واحد من أصل 256 في عدد السكان الناتجة من النسل. ان الكشف عن هذا الشخص بالطرق التقليدية نادرة يكون العمل المكثف جدا. وبالمقارنة ، فإن استخدام آيس كاب لهذا المشروع يوفر للعالم مع استراتيجية فعالة لتحديد زيجوت متماثلة الألائل النادرة أربعة أضعاف في غضون جيل واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> iTILLING. مختبرنا وصف مؤخرا نهجا جديدا لتحري وجود الطفرات المستحثة في الجينات ذات الأهمية في 7 Arabidopsis. هذا الأسلوب هو الاختلاف على أسلوب يسمى الحرث المنشأة التي تستخدم لإيجاد طفرات في أمر السكان من الأفراد تعامل مع المواد الكيميائية مطفر 8-10. وقد سميت نحن لدينا وسيلة لأنه iTILLING إصدار فردية من حراثة الذي يسمح لدائرة الهجرة والجنسيةعالم ividual لإنجاز شيء ما قد يلزم تقليديا فريق بحثي كبير لإكمال. الايس كاب يشكل جزءا لا يتجزأ من أسلوب iTILLING 7 ، كما هو موضح أدناه. </li></ol> الفكرة وراء iTILLING هو إنتاج مجموعة سكانية سريعة الزوال متحولة ، والتي تقف على النقيض من سكان متحولة الدائم لخلق مشاريع حراثة التقليدية. لiTILLING ، وزرعت بذور من سكان M2 متضخم في 5-10 كتل الجليد كاب ، ويتم استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة رسملة الجليد. ثم توضع الشتلات Arabidopsis في 4 درجات مئوية في حين يتم تنفيذ فحص الحمض النووي الطفرة باستخدام الآيس كاب محضرات. يتم تخزين شتلات الطماطم على 12 درجة مئوية. مرة واحدة وقد تم تحديد الطفرات الشتلات تحمل المطلوب ، واستعادة هذه المادة من لوحات الآيس كاب ونقل إلى التربة. وليس المقصود iTILLING لتوفير السكان طويلة الأمد متحولة لمجتمع البحوث بأكمله إلى الشاشة. بدلا من ذلك ، يوفر استراتيجية iTILLING التييمكن للمرء أن عدد سكان العالم شاشة مخصصة متحولة عن طفرات في حفنة من الجينات بسرعة وكفاءة ، وبتكلفة منخفضة نسبيا. لقد تم العثور على الجليد رسملة لتكون وسيلة فعالة للنمو والتنميط الجيني Arabidopsis ، والبندورة ، والأرز. نتوقع أن الأنواع الأخرى من النباتات وينبغي أيضا أن تكون قابلة للكاب الجليد. أحد قيود على مجموعة متنوعة من الأنواع التي يمكن استيعابها من قبل الآيس كاب هو حجم البذور. وسوف النباتات فقط مع بذور صغيرة بما يكفي لتناسب آبار لوحة 96 - جيدا تكون متوافقة مع كاب الجليد في التكوين الحالي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> سبكس / CertiPrep ، Metuchen ، NJ </td><td> 2000 جينو / طاحونة </td><td> آلة لزعزعة لوحات لاستخراج الجذر الحمض النووي </td></tr><tr><td> ABgene الحرارية السدادة </td><td> ABgene الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> AB - 0384 </td><td> دليل ختم الآلة الحرارة المستخدمة في لوحات الجذر قبل انقطاع الأنسجة </td></tr><tr><td> الطرد المركزي مجهزة ناقلات microplate يتأرجح </td><td> بيكمان كولتر </td><td> أليجرا 25R </td><td> فإن أي الطرد المركزي مع شركات microplate يتأرجح تكون مناسبة </td></tr><tr><td> MicroFill Microplate الصيدلي </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> السائل موزع الآلي لملء microplates </td></tr><tr><td> Bialetti العلامة التجارية17x11 بوصة ورقة تجارية كبيرة كوكي </td><td> هدف متجر </td><td> www.bialetti.com </td><td> هذه الورقة كوكي محددة لديه عمق مثالية للآيس كاب </td></tr><tr><td> صنع رفوف معدنية مخصصة </td><td> الأجهزة مخزن </td><td></td><td> انظر النص الكامل لوصف </td></tr><tr><td> 33 ليتر مربع التخزين البلاستيكية </td><td> هدف متجر </td><td> Sterilite الماركة </td><td> لآيس كاب النافورة. البلاستيك المربع تخزين كبيرة بما يكفي لعقد 17x11 بوصة ورقة الكعكة </td></tr><tr><td> 30 غالون لكل ساعة مضخة النافورة </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> مضخة غاطسة صغيرة نافورة متوفرة في مخازن الامدادات حديقة </td></tr><tr><td> خرطوم مضخة لنافورة </td><td> أي شركة تزويد المختبر </td><td></td><td> متوافق مع مضخة النافورة خرطوم </td></tr><tr><td> البلاستيك المشبك </td><td> الأجهزة مخزن </td><td></td><td> المشبك لعقد خرطوم إلى كوكيورقة </td></tr><tr><td> الأغطية البلاستيكية واضحة من القاع المسطح Microtest فالكون 96 - جيدا لوحات البوليسترين </td><td> فالكون دينار بحريني www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> الأغطية البلاستيكية لتغطية واضحة لوحات الشتلة الآيس كاب </td></tr><tr><td> 3M Micropore الشريط الجراحية </td><td> فيشر العلمية </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch كرات الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها </td><td> هارتفورد تكنولوجيز ، روكي هيل CT </td><td> 034-006 - 1K </td><td> تستخدم لتعطيل جذر الأنسجة بعد الحصاد </td></tr><tr><td> 3 بوصة العصابات الشعر مطاطا </td><td> المحلية محل بقالة </td><td></td><td> تستخدم لتأمين لوحة لوحة جذر الشتلة </td></tr><tr><td> 4 أسياخ خشبية مم </td><td> المحلية محل بقالة </td><td></td><td> وعادة ما تستخدم لإعداد هذه أسياخ kabobs </td></tr><tr><td> فيشر العلمية نونك العلامة التجارية ، 1 مل من دون لوحات تصفية فريت </td><td> فيشر العلمية </td><td> 278012 </td><td> لوحات الشتلة 96 - جيدا مع ثقوب في القاع. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96 - حسنا تل - PCR المدخنة بلايت </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-230-242 </td><td> لوحات روت 96 - جيدا </td></tr><tr><td> آغار -- ثقافة خلية اختبار </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 - Morpholinoethanesulfonic حمض (MES) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige وسكوغ (MS) القاعدية الخليط الملح </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M - 5524 </td><td></td></tr><tr><td> الحرارة سهل التقشير ختم احباط </td><td> ABgene الولايات المتحدة الأمريكية. </td><td> AB - 0745 </td><td> الحرارة فيلم الختم عن لوحات الختم الجذر قبل انقطاع الأنسجة </td></tr><tr><td> بطة العلامة التجارية على نطاق واسع خارج الشريط التعبئة والتغليف ، 3.00 &quot;س 54.6 يارد </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> البند لا. 21242139 </td><td> شريط لاصقلmicroplates ختم تتضمن مقتطفات الحمض النووي للتخزين </td></tr><tr><td> ختم الرول </td><td> بيو راد </td><td> MSR - 0001 </td><td> أمسك بيد المتداول أداة للضغط على شريط لاصق على ختم microplates </td></tr><tr><td> 96 - جيدا كتلة معدنية الحرارية </td><td> الغمد Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> تستخدم لتجميد الجذر لوحات للحصاد الأنسجة </td></tr><tr><td> Whatman تصفية الورق </td><td> Whatman الدولية </td><td> 1002 090 </td><td> تستخدم لتعقيم البذور السطح </td></tr><tr><td> المتاح باستور الماصة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-678 - 6A </td><td> 5 ¾ &quot;المتاح باستور ماصة تستخدم لنقل البذور لوحة الشتلة </td></tr><tr><td> صحن الخبز بيركس (20 سم x 30 سم) </td><td> هدف متجر </td><td></td><td> استخدمت لبناء جليد جاف / الإيثانول الحمام. </td></tr></tbody></table>

ice-cap: a method for growing arabidopsis and tomato plants in 96-well plates for high-throughput genotyping

أنه أصبح من الشائع للعلماء النبات لتطوير المشاريع التي تتطلب التنميط الجيني لأعداد كبيرة من النباتات. الخطوة الأولى في أي مشروع التنميط الجيني هو جمع عينة من نسيج كل مصنع على حدة. النهج التقليدي لهذه المهمة هو عينة واحدة النباتات المعرضة للوقت. إذا كان أحد يرغب في التركيب الوراثي أو مئات الآلاف من الأفراد ، إلا أن استخدام هذه النتائج الاستراتيجية في اختناق كبير في خط أنابيب التنميط الجيني. الأسلوب آيس كاب التي وصفنا هنا يوفر حلا عالي الإنتاجية لهذا التحدي من خلال السماح لأحد العلماء جمع الأنسجة من عدة آلاف من شتلات 1،2 في يوم واحد. يتكون هذا المستوى من سرعة ممكنة من خلال حقيقة أن الأنسجة التي تحصد من النباتات المعرضة لل96 مرة ، بدلا من واحد في وقت واحد في. الأسلوب آيس كاب يوفر منصة متكاملة لأداء نمو الشتلات والحصاد الأنسجة ، واستخلاص الحمض النووي. الأساس لآيس كاب هو نمو seedliNGS في زوج من مرصوف 96 - جيدا لوحات. آبار لوحة تحتوي على شمعات العلوي من وسائط النمو التي أغار على الشتلات الفردية تنبت. الجذور تنمو باستمرار عبر وسائل الإعلام آغار ، الخروج من لوحة العلوي من خلال ثقب ، وتمر في المياه التي تحتوي على أقل وحة. لحصاد الأنسجة لاستخراج الحمض النووي ، والماء في الطبقة السفلى من لوحة تحتوي على أنسجة الجذر المجمدة بسرعة في حين أن الشتلات في الصفيحة العليا تبقى في درجة حرارة الغرفة. غير المقشر ثم لوحة العليا بعيدا عن انخفاض لوحة ، مما أسفر عن إحدى الصفائح مع 96 عينات الأنسجة المجمدة في جذر واحد لوحة الجليد مع 96 شتلة قابلة للحياة. يسمى هذا الأسلوب &quot;آيس كاب&quot; لأنه يستخدم الثلج لالتقاط الأنسجة الجذر. يمكن للوحة 96 - جيدا يحتوي على شتلات ملفوفة في احباط وثم نقل إلى درجة حرارة منخفضة. علقت هذه العملية مزيدا من النمو من الشتلات ، ولكن لا يؤثر على قدرتها على الاستمرار. مرة واحدة وقد تم الانتهاء التحليل الوراثي ، يمكن نقل الشتلات مع التركيب الوراثي المطلوب من ع 96 - جيدافي وقت متأخر إلى التربة لمزيد من الانتشار. لقد أثبتنا في جدوى الأسلوب الآيس كاب باستخدام thaliana Arabidopsis ، والبندورة ، وشتلات الأرز. نتوقع أن الأسلوب يجب أن تنطبق أيضا على أنواع أخرى من النباتات ذات البذور صغيرة بما يكفي لتناسب آبار 96 - جيدا لوحات.

Watch this Scientific Journal Video about Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping at JoVE.com

الغطاء الجليدي: طريقة لزراعة نباتات الأرابيدوبسيس والطماطم في 96 بئرًا للتنميط الجيني عالي الإنتاجية | الأحياء | فيديو

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

الأسلوب آيس كاب يسمح احد لتنمو النباتات في لوحات 96 - جيدا وغير المدمر أنسجة الجذر الحصاد من كل الشتلات. ويمكن استخدام الحمض النووي المستخرج من نسيج هذا الجذر لتفاعلات التنميط الجيني. لقد وجدنا أن الآيس كاب يعمل بشكل جيد لل<em&gt; thaliana Arabidopsis</em&gt; والطماطم والأرز والشتلات.

الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Plant Biology

Plant Reproduction

SCIENTISTS IN ACTION

22.7K Views.  University of Wisconsin-Madison. الأسلوب آيس كاب يسمح احد لتنمو النباتات في لوحات 96 - جيدا وغير المدمر أنسجة الجذر الحصاد من كل الشتلات. ويمكن استخدام الحمض النووي المستخرج من نسيج هذا الجذر لتفاعلات التنميط الجيني. لقد وجدنا أن الآيس كاب يعمل بشكل جيد لل thaliana Arabidopsis والطماطم والأرز والش...

Video: Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...