وأيد هذا العمل من قبل شركة التأمين على الحياة &quot;AG2R - LA - مونديال&quot; ، مدرسة قصر العلوم العصبية في باريس (ENP) ، والوكالة الوطنية للبحوث دي لا &quot;ANR - 09 - NEUR - 004&quot; في إطار نيورون إيرانيت &quot; &quot;من FP7 البرنامج من قبل المفوضية الأوروبية ومؤسسة باستور. وأيد سيباستيان فاغنر من قبل مؤسسة يتين ممثل.

1. معايرة البصرية : السلطة LED قياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق مجموعة أدى إلى غرفة التبريد المبردة بنشاط مروحة ويلصق هذا الصمام aparatus / غرفة التبريد لعدسة الموازاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المصابيح المستخدمة في إنارة LED مع brightfield / heatsink / فان / جهاز العدسة. يجب أن يكون هذا الجهاز في وضع بعناية بحيث شعاع موازى LED يسافر على طول مسار بصري مباشرة نحو العدسة المكثف. تأكد يرتكز بشكل صحيح heatsink / فان على أرض الواقع للنظام الموحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محرك الصفيف LED مع إمدادات الطاقة التي يمكن أن تقدم سريع والبقول مربع من الحالية. ويمكن السيطرة على هذا التيار الكهربائي بواسطة نبضة TTL 5V مصدرها مولد النبض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز شعاع موازى على طول مسار ضوء المعرفة بين الحجاب الحاجز الميدانية وعدسة المكثف. من الناحية المثالية ، فإن شعاع الصمام قليلا فعم الحجاب الحاجز فتح المجال كاملا. عادة ، فإن شعاع اشد على اياديكم موازى الصمام لسد هذه الفتحة أقل ، وسوف تنتج موره السلطة على حساب التوحيد. في الإعداد لدينا زدنا ضوء التوحيد عن طريق اختيار العدسة التي من المتوقع الموازاة صورة موسعة قليلا من مجموعة LED في طائرتها المتقارن في الحجاب الحاجز consenser. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيق كولر الإضاءة من خلال التركيز المكثف بحيث يتم التركيز على صورة الحجاب الحاجز الميدان (الحجاب الحاجز الأقرب إلى مصدر الضوء) على الغرفة شريحة (الشكل 1). ويمكن لأنسجة رقيقة من الورق عدسة بمثابة شاشة عرض لتصور صورة مركزة للحجاب الميدانية في أعماق أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر سلسلة من الثقوب في الإطارات المعروفة في مادة معتمة. مكان واحد من هذه الثقوب الصغيرة على جهاز استشعار للمتر الطاقة الضوئية. وضع السلطة متر على المسرح العينات ومركز السلطة متر فوق الصورة مركزة للحجاب الحقل بمجرد تحريك العداد السلطة حتى أنه يعطي قراءة الحد الأقصى. اللاحقه المقياس السلطة في هذا المنصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الكامل لجميع الفتحات (الحجاب الحاجز وaperatureحقل الحجاب الحاجز). تحرك بشكل منهجي تعلق شريحة الغرفة / القوة النسبية للمتر lightpath البصرية وحساب الطاقة الضوئية من التوحيد في المنطقة المضاءة. بناء مؤامرة التوحيد للنظام الخاص بك. إذا المجهر هو صحيح الإعداد مع إضاءة كوهلر محورها التركيز على الهدف ، ينبغي أن تكون الطاقة القصوى مباشرة تحت هذا الهدف ، والمناطق خارج هذا التركيز الآن يجب أن تتلقى كمية معروفة من السلطة وفقا للمؤامرة التوحيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل حجم الثقب ، وبناء منحنى مستوى الطاقة الضوئية مقابل مساحة الثقب. وذلك بضبط المدخلات الحالية لمجموعة الصمام ، وينتج هذا المنحنى في عدة مستويات من الطاقة وكل منحنى من حساب السلطة في MM2. إذا كانت مجموعة LED لاستخدامه للبصريات التصحيح ، تأكد من أن أعرض العناصر البصرية الضرورية لترميم (المكثفات ، والثقوب والمرشحات) لتعرف كم تبث تحت ضوء إنارة التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقليب في السلطة متر للمواجهة موضوعية ، وحساب شدة الإضاءة في 470nm عندما يتم تشغيل مصباح الزئبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة شريحة ناري في الغرفة ، وإعادة بناء منحنيات معيار لتحديد قوة الضوء التي تنتقل عن طريق نثر أنسجة المخ. </li></ol> 2. تشريح الإجرائية والكهربية جزء : إعداد شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير (60 ملغ / كغ والكيتامين زيلازين 2mg/kg) وقطع رأس الماوس. تشريح الدماغ في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF في ملي : 124 كلوريد الصوديوم ، 3 بوكل ، 1.3 MgSO 4 و 26 NaHCO 3 ، 1.25 NaHPO 4 و 20 الجلوكوز ، 2 CaCl 2 ؛ ~ 310mOsm ، ودرجة الحموضة 7.4 عندما انفجر بمزيج من O2 أكسيد الكربون بنسبة 95 ٪ و 5 ٪ 5،1 2) ، مع الحرص على عدم إتلاف بصيلات الشم. فصل نصفي الكرة الأرضية ومكان على السطح مع آغار بطني حتى مع حافة واحدة (لمقاطع أفقية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء آغار والسطح الظهري من كل نصف الكرة القشرية إلى vibratome تشوك ، وملء ببطء مع حمام بارد كالثلج ACSF. شريحة من السطح البطني في 300 ميكرون أقسام ، كل قسم لنقل حرارة (34-36 درجة مئوية) وACSF الاوكسيجين ، مما يسمح لهم باسترداد عن 30-45 دقيقة. </li></ol> الجزء باء : قطع تصحيح القياس من العتبة إلى سبايك <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إحضار الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ومكان بلطف شريحة في غرفة تسجيل لغرفة تحت المجهر نضح المستمر ACSF الاوكسيجين. خطر تحفيز الخلايا العصبية المفرطة ChR2 المصابة ، ويمكن تأكيد وجود EYFP - ChR2 تحت epifluorescence (الشكل 2A) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أقطاب الزجاج على مجتذب ماصة (سوتر P - 97). ملء هذا القطب مع ACSF. عند وضعها في الحمام ACSF ينبغي أن يكون بين طرف المقاومة MOhms 70-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت إضاءة الفلورسنت ، وتحديد موقع في شريحة صحية ChR2 - EYFP عصبون مع التشكل ناضجة. أيضا تحديد موقع هذه الخلايا العصبية سوما تحت البصريات الترقيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الضغط الايجابي ضوء مرت غيض الكهربائي ، وانخفاض القطب التصحيح نحو الخلايا العصبية التي تم تحديدها في نيون. عندما يتم الاتصال الغشاء ، والإفراج بسرعة وتطبيق الضغط الايجابي على كمية صغيرة من الشفط وجيزة من خلال التلميح. وينبغي بذل ختم GIGA أوم بين غشاء البلازما والجدران من القطب التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حتى إذا لم يتم تشكيل جيغا الختم ، إذا كان القطب قريب بما فيه الكفاية لنشاط الخلايا العصبية فلوري التشويك ينبغي قياس إمكانات إنتاج الحقل المحلي. تنشيط الخلايا العصبية في هذا ChR2 التي تومض جرعات مختلفة من الضوء. لأن الخفيف الجرعة هي وظيفة كل من السلطة الصمام والمدة ، وكيفية حساب الكثير من الضوء الضروري استحضار إمكانات العمل في قوى متعددة وفترات (الشكل 2B). نلاحظ أيضا كم التشويك يحدث تحت إضاءة مصباح الزئبق. </li></ol> 3. ممثل النتائج : على المجهر لدينا (أوليمبوس BX51WI) ، الصمام لدينا هو طن 2 تمشيا مع فتحات عدسة والمكثف ، وبالتالي الحفاظ على lightpath الأصلي للمصنع تركيب مصباح القوس. عن طريق إغلاق كل من الميدان والحجاب الحاجز الحجاب الحاجز aperature ، يمكننا تحقيق brightfield النقيض كافية للتسجيلات التصحيح المشبك (الشكل 1B). مع جميع أغشية مفتوحة بالكامل علينا أن نفضح شريحة إلى السلطة ضوء الحد الأقصى لتفعيل channelrhodopsin (الشكل 1A). على المجهر لدينا ، هذا التكوين التصحيح ينتج ضوء الكثافة أن نحو ثلاثة أوامر من حجم أقل من الحد الأقصى لكثافة الحقل الكامل (4.1 μW / مم 2 ميغاواط مقابل 6،88 / مم 2). نرى العلامات قوية من البالغين المولودين في الحبيبية البصلة الشمية وperiglomerular أسابيع الخلايا العصبية بعد الإصابة lentiviral ترحيل neuroblasts في تيار الهجرة منقاري (الشكل 2A) وتسجيل فضفاضة التصحيح من احد الكبار المولد ChR2 - EYFP معربا عن الخلية الحبيبية يشير إلى أن لتحفيز مللي 5 في المأثورأم السلطة (6،88 ميغاواط / مم 2) كافية لاستحضار التشويك (الشكل 2B). منذ مستوى التعبير تختلف بين الخلايا ، فإن كمية الضوء الذي يمر على عتبة ارتفاع تختلف ، وينبغي أن يوصف إحصائيا لكل نوع من الخلايا في المصالح. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الصمام الإعداد لمجموعة كاملة حقل ضوئي والتصحيح ، المشبك الكهربية شريحة. لتنشيط channelrhodopsin (ChR2) ونحن مشروع شعاع موازى من خلال فتحات خلفية مفتوحة والبصريات المكثف (أ). يمكن تغيير هذا التكوين في البصريات الترقيع عالية التباين عن طريق إغلاق الحاجز بالكامل الميدانية وتحوير عرض الحجاب الحاجز الحقل (ب). المختصرات : (أ) مروحة ، خافض الحرارة ب ، ج مجموعة LED ، د عدسة الموازاة ، مرآة ه ، F. حجاب الميدان ، ز غشاء الفتحة ، ح عدسة المكثف ، ط ساmple المرحلة ، ي موضوعية. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صورة شريحة أفقية 300μm من البصلة الشمية لالمشبك التصحيح وضوئي كامل الحقل (أ). ويمكن رؤية المصابين Lentivirally الخلايا الحبيبية البالغين المولودين في التعبير عن ChR2 - EYFP يشع من جوهر البصلة الشمية. يمكن العثور على الخفيف الجرعة المطلوبة لاستحضار ارتفاعه عن طريق زيادة مدة فلاش LED (ب). وكان الحد الأدنى لهذه الخلية الحبيبية 5ms الكامل في كثافة LED (2.43mW/mm 2). النطاق في (أ) = 500μm ، في نطاق 50ms = (ب).

<ol>
	<li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb.">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li><li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli.">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li><li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction:+development+and+adult+neurogenesis.">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-breakers:+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems.">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li><li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array.">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li><li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse.">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li><li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting.">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li><li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells.">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment.">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 .</li><li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد شهدت السنوات الأخيرة انفجارا في شعبية أدوات optogenetic للبحوث علم الأعصاب 6. نتيجة لذلك ، من المهم بصورة متزايدة لخفض الحواجز لدخول المختبرات الراغبة في البدء في استخدام هذه الأدوات الجديدة. هنا ونحن تصف كيفية إجراء التعديل التحديثي بسيطة ومنخفضة التكلفة ومعاي...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Type</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>Imalg&egrave;ne 1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>2%</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbps;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>P5405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>M1880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5761</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G7021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>C7902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>A9539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>1.5 mm O.D./1.17 mm I.D.</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150T-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED array</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bridgelux</td>
			<td>BXRA-C2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>40 mm beam diameter</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>2.8 amp</td>
			<td>A1W Electronik</td>
			<td>HKO2800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PM 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatsink </td>
			<td>Silent Boost K8</td>
			<td>Thermaltake</td>
			<td>A1838</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fan</td>
			<td>Silent Boost K8</td>
			<td>Thermaltake</td>
			<td>A1838</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using affordable led arrays for photo-stimulation of neurons

وقد سمح معيار الكهربية شريحة الباحثين للبحث في المكونات الفردية للدوائر العصبية من خلال تسجيل الاستجابات الكهربائية للخلايا واحد ردا على 1،2 التلاعب الكهربائية أو الدوائية. مع اختراع وسائل للسيطرة على الخلايا العصبية الموجهة بصريا وراثيا (optogenetics) ، قام الباحثون الآن إلى مستوى غير مسبوق من السيطرة على مجموعات معينة من الخلايا العصبية في إعداد شريحة القياسية. على وجه الخصوص ، حساس channelrhodopsin - 2 (ChR2) يسمح للباحثين لتنشيط الخلايا العصبية مع 3،4 الخفيفة. من خلال الجمع بين معايرة دقيقة من الصمام المستندة ضوئي من ChR2 مع شريحة الكهربية القياسية ، ونحن قادرون على تحقيق مع بمزيد من التفصيل دور الكبار المولد interneurons في البصلة الشمية ، تتابع المركزي الأول للنظام حاسة الشم. استخدام التعبير الفيروسية ChR2 - YFP تحديدا في البالغين المولودين في الخلايا العصبية ، نستطيع السيطرة بشكل انتقائي الشباب البالغين المولودين في الخلايا العصبية في الوسط من قديمةد الخلايا العصبية الناضجة. سيطرتنا بصري يستخدم نظام الصمام بسيطة وغير مكلفة ، ونظهر كيف يمكن معايرة هذا النظام لفهم كيف يمكن لحاجة الكثير من الضوء لاستحضار التشويك نشاط الخلايا العصبية في واحدة. وبالتالي ، لا يمكن ومضات قصيرة من الضوء الأزرق التحكم عن بعد في نمط اطلاق ChR2 - transduced خلايا الوليد.

Watch this Scientific Journal Video about Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons at JoVE.com

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

ويمكن التلاعب بها الكبار المولد معربا عن الخلايا العصبية في التحضيرات ChR2 شريحة الكهربية من أجل دراسة مساهمتها في وظيفة الدارات العصبية الشمية.

بأسعار معقولة باستخدام صفائف الصمام لتحفيز الخلايا العصبية ، صور

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.5K Views.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). ويمكن التلاعب بها الكبار المولد معربا عن الخلايا العصبية في التحضيرات ChR2 شريحة الكهربية من أجل دراسة مساهمتها في وظيفة الدارات العصبية الشمية.

Video: Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larval zebrafish are emerging as a model for describing the development and function of simple neural circuits. Due to their external fertilization, rapid development, and translucency, zebrafish are particularly well suited for optogenetic approaches to investigate neural circuit function. In this approach, light-sensitive ion channels are expressed in specific neurons, enabling the experimenter to activate or inhibit them at will and thus assess their contribution to specific behaviors. Applying these methods in larval zebrafish is conceptually simple but requires the optimization of technical details. Here we demonstrate a procedure for expressing a channelrhodopsin variant in larval zebrafish somatosensory neurons, photo-activating single cells, and recording the resulting behaviors. By introducing a few modifications to previously established methods, this approach could be used to elicit behavioral responses from single neurons activated up to at least 4 days post-fertilization (dpf). Specifically, we created a transgene using a somatosensory neuron enhancer, CREST3, to drive the expression of the tagged channelrhodopsin variant, ChEF-tdTomato. Injecting this transgene into 1-cell stage embryos results in mosaic expression in somatosensory neurons, which can be imaged with confocal microscopy. Illuminating identified cells in these animals with light from a 473 nm DPSS laser, guided through a fiber optic cable, elicits behaviors that can be recorded with a high-speed video camera and analyzed quantitatively. This technique could be adapted to study behaviors elicited by activating any zebrafish neuron. Combining this approach with genetic or pharmacological perturbations will be a powerful way to investigate circuit formation and function.

Optogenetic techniques have made it possible to study the contribution of specific neurons to behavior. We describe a method in larval zebrafish for activating single somatosensory neurons expressing a channelrhodopsin variant (ChEF) with a diode-pumped solid state (DPSS) laser and recording the elicited behaviors with a high-speed video camera.

Optogenetic تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية اسماك الزرد باستخدام الشيف-tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

إنتاج وعزل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية لتحليل الكيمياء الحيوية باستخدام مرشحات المسامية

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). Although mouse models of tauopathy have provided a valuable resource for investigating the neurotoxic mechanisms of aggregated tau, it is becoming increasingly apparent that, due to interspecies differences in neurophysiology, the mouse brain is unsuitable for modeling the human condition. Advances in cell culture methods have made human neuronal cultures accessible for experimental use in vitro and have aided in the development of neurotherapeutics. However, despite the adaptation of human neuronal cell cultures, in vitro models of human tauopathy are not yet widely available. This protocol describes a cellular model of tau aggregation in which human neurons are transduced with lentiviral-derived vectors that code for pathogenically mutated tau fused to a yellow fluorescent protein (YFP) reporter. Transduced cultures produce tau aggregates that stain positively for thioflavin and display markers of neurotoxicity, such as decreased axonal length and increased lysosomal volume. This procedure may be a useful and cost-effective model for studying human tauopathies.

This protocol details a procedure in which human neuronal cultures are transduced with lentiviral constructs coding for mutant human tau. Transduced cultures display tau aggregates and associated pathologies.

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of scientific and clinical development. The use of flexible polymer electrode arrays can support long-lasting recording, but the same mechanical properties that allow for longevity of recording make multiple insertions and integration into a chronic implant a challenge. Here is a methodology by which multiple polymer electrode arrays can be targeted to a relatively spatially unconstrained set of brain areas.
The method utilizes thin-film polymer devices, selected for their biocompatibility and capability to achieve long-term and stable&#160;electrophysiologic recording interfaces. The resultant implant allows accurate and flexible targeting of anatomically distant regions, physical stability for months, and robustness to electrical noise. The methodology supports up to sixteen serially inserted devices across eight different anatomic targets. As previously demonstrated, the methodology is capable of recording from 1024 channels. Of these, the 512 channels in this demonstration used for single neuron recording yielded 375 single units distributed across six recording sites. Importantly, this method also can record single units for at least 160 days.
This implantation strategy, including temporarily bracing each device with a retractable silicon insertion shuttle, involves tethering of devices at their target depths to a skull-adhered plastic base piece that is custom-designed for each set of recording targets, and stabilization/protection of the devices within a silicone-filled, custom-designed plastic case. Also covered is the preparation of devices for implantation, and design principles that should guide adaptation to different combinations of brain areas or array designs.

Described below is a method for implantation of multiple polymer electrode arrays across anatomically distant brain regions for chronic electrophysiological recording in freely moving rats. Preparation and surgical implantation are described in detail, with emphasis on design principles to guide adaptation of these methods for use in other species.

الزرع المزمن للصفائف متعددة البوليمرات المرنة

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).