وأيد هذا العمل من قبل NHI R01 منحة GM59690 منحت لKLV.

<ol>
	<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms.">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).</li><li>Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+as+complex+differentiated+communities.">Biofilms as complex differentiated communities.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20 (2005).</li><li>Branda, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).</li><li>Beyhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+rugosity+and+biofilm+formation+in+Vibrio+cholerae:+comparison+of+VpsT+and+VpsR+regulons+and+epistasis+analysis+of+vpsT,+vpsR,+and+hapR.">Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR.</a> J. Bacteriol. 189, 388 (2007).</li><li>Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+biofilm+development+of+opaque+and+translucent+Vibrio+parahaemolyticus.">Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus.</a> Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).</li><li>Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SadC+reciprocally+influences+biofilm+formation+and+swarming+motility+via+modulation+of+exopolysaccharide+production+and+flagellar+function.">SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function.</a> J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).</li><li>Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+symbiosis+regulator+rscS+controls+the+syp+gene+locus,+biofilm+formation+and+symbiotic+aggregation+by+Vibrio+fischeri.">The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).</li><li>Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+a+novel+response+regulator+is+necessary+for+biofilm+formation+and+host+colonization+by+Vibrio+fischeri.">Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).</li><li>Nyholm, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Vibrio+fischeri+and+nonsymbiotic+bacteria+in+the+dynamics+of+mucus+secretion+during+symbiont+colonization+of+the+Euprymna+scolopes+light+organ.">Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).</li><li>Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+conserved+cluster+of+genes+promotes+symbiotic+colonization+and+Ï&#x0192;54-dependent+biofilm+formation+by+Vibrio+fischeri.">A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and Ï&#x0192;54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri.</a> Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).</li><li>Mandel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+regulatory+gene+is+sufficient+to+alter+bacterial+host+range.">A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range.</a> Nature. 458, 215 (2009).</li><li>Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+transposon-induced+motility+mutations+on+colonization+of+the+host+light+organ+by+Vibrio+fischeri.">Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).</li><li>Geszvain, K., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hybrid+sensor+kinase+RscS+integrates+positive+and+negative+signals+to+modulate+biofilm+formation+in+Vibrio+fischeri.">The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri.</a> J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).</li><li>Krasteva, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+VpsT+regulates+matrix+production+and+motility+by+directly+sensing+cyclic+di-GMP.">Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP.</a> Science. 327, 866 (2010).</li><li>Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rdar+morphotype,+a+multicellular+behaviour+in+Enterobacteriaceae.">Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae.</a> Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).</li><li>Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rippling+is+a+predatory+behavior+in+Myxococcus+xanthus.">Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus.</a> J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).</li><li>Lee, K., Veeranagouda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicrocells+form+by+reductive+division+in+macroscopic+Pseudomonas+aerial+structures.">Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures.</a> Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا العمل، ونحن وصفا لطريقة شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri بوصفه الكائن نموذج. على وجه التحديد، ونحن الاستفادة من مجهر تشريح مع المرفقات كاميرا لمراقبة تشكيل بيوفيلم والتنمية وتشكيل مستعمرة التجاعيد مع مرور الوقت على سطح صلب أجار. في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة 2 أنواع محددة من الطرق التي نستخدمها عادة لتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. الأول هو فحص نقطة النهاية، والذي يتيح لنا مراقبة، شامل نهائي الهندسة المعمارية 3D، والزخرفة، وقطر لثقافة رصدت في &quot;النهائي&quot; المحدد نقطة مرة. هذا النهج هو أكثر فائدة لتقييم سلالات متحولة أو الظروف التي تؤدي إلى تشوهات كبيرة في تشكيل بيوفيلم. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يميز بين الاختلافات أكثر دهاء وقعت في نقطة زمنية قبل نقطة النهاية المحددة. على نحو أوثق مراقبة التجاعيد تشكيل مستعمرة، نستخدم فحص مسار الزمن، والتي تتيح لنا التعرف بداية ثrinkled تشكيل مستعمرة ومراقبة تطورها على مر الزمن. نتيجة لهذا النهج، يمكن تحديد الاختلافات أكثر دهاء في توقيت تشكيل مستعمرة التجاعيد، والهندسة المعمارية 3D، والزخرفة. استخدمنا هذا الفحص بالطبع وقت لتوليد المؤسستين شبه كمي المقايسات من تشكيل بيوفيلم. أولا، يمكن مقارنة الوقت الذي سلالة يبدأ في تطوير الهندسة المعمارية 3D إلى أن سلالات السيطرة. لقد وجدنا أن التأخير في تشكيل بيوفيلم من متحولة خاصة في ظل نفس الظروف ويتسق إلى حد ما 9. على سبيل المثال، في البيانات التي تظهر في الشكل. 2، ومتحولة برهنوا دائما عن تأخير ح 4 في الشروع في تشكيل بيوفيلم. ثانيا شبه كمي قدر من تشكيل بيوفيلم هو التغير في حجم القطر من مستعمرة التجاعيد (سبوت). لقد وجدنا أن قطر المستعمرات التجاعيد تختلف تدريجيا من أن من غير بيوفيلم المستعمرات، ليبلغ نحو فرقا 2-أضعاف في نهاية الوقت نقطة (الشكل 3 </قوي&gt;) (موريس وVisick، بيانات غير منشورة). حتى الآن، ونحن لم احظ أحد النمط الظاهري دون الآخر (أي تشكيل بيوفيلم دون زيادة في القطر مستعمرة) (بيانات غير منشورة)، على الرغم من أنه لا يزال ممكنا بعض المسوخ وسوف تتصرف بشكل مختلف. في الواقع، فقد أفيد عن V. الكوليرا أن بعض التجاعيد في المستعمرات نتيجة زيادة كبيرة في القطر مستعمرة في حين أن البعض الآخر لا 15. ومع ذلك، يمكن تقييم التغيير في قطر مع مرور الوقت مساعدة في توصيف المسوخ بيوفيلم المحتملة و / أو توفير تدبير إضافي الكمية من المسوخ مع التأخير في عملية التنمية. من التدابير اثنين من تشكيل بيوفيلم (الوقت وقطر)، وتحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد أكثر حساسية، ولكن أيضا أكثر ذاتية، من تحديد القطر من بقعة. وحتى مع ذلك، على حد سواء التدابير تقديم تقييم نصف الكمية من النمط الظاهري يمكن أن يكون مفيدا للغاية للباحثين بيوفيلم لكن غير قابلة بسهولة إلى quantificatioن. عند إجراء فحوصات مثقف رصدت، من المهم للنظر في الظروف البيئية التي يتم استزراع سلالات رصدت. ويتأثر في كثير من الأحيان التجاعيد تشكيل مستعمرة من قبل الظروف البيئية المختلفة، بما في ذلك توفر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة والرطوبة. للحد من التباين بين التجارب، فإنه من المفيد لتوحيد هذه الظروف قدر المستطاع (أي توحيد لوحات أجار إلى وحدة تخزين مجموعة وزراعة سلالات رصدت في درجة الحرارة التي تسيطر عليها). لمزيد من السيطرة على التباين بين التجارب اكتشاف، من المهم أن تشمل سلالات المراقبة المناسبة داخل كل مجموعة من التجارب. أخيرا، عند تفسير البيانات من هذه المقايسات، فمن الضروري إجراء أية تجربة 1 عدة مرات (3 +)، وخصوصا عندما تقييم الفروق الدقيقة في تشكيل مستعمرة التجاعيد (على سبيل المثال، في تأخير تشكيل بيوفيلم أو الاختلافات الزخرفة). بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي: 1) determinقد جي ما إذا كانت الخلايا لديها خلل في النمو يكون من الصعب: نمو الخلايا في ثقافة السائل قد لا تعكس بدقة معدلات النمو في وسائل الاعلام الصلبة، وتحديد دقيق لنمو الخلايا المكونة للبيوفيلم، والتي قد تلتصق ببعضها البعض، قد لا يكون ممكنا؛ 2) سوف سلالات مع عيوب نمو أن يكون مشكلة لتحليل، 3) أنه قد لا يكون من الممكن التمييز بين الاختلافات بين سلالات قطر مع الظواهر بيوفيلم خفية، 4) عن السلالات التي لا تنمو في حلقة مركزية من أنه قد لا يكون من الممكن قياس بدقة تغييرات في قطر، 5) في حين يمكن ملاحظة الزخرفة خلال تشكيل بيوفيلم، لا توجد وسيلة لقياس الزخرفة للبيوفيلم الناتجة عن ذلك؛ و 6) لا توجد وسيلة لقياس Z-البعد عن بيوفيلم مع هذه التجربة انشاء . على الرغم من هذه القيود، يتيح هذا البروتوكول مع ذلك وسيلة للحصول على البيانات الرقمية للمساعدة في تقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. في هذا البروتوكول، ونحن الاستفادة من التصوير محددنظام (أي مجهر زايس تشريح وبروخرس CapturePro برامج التصوير) لمراقبة وتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. نظام التصوير وصفها هنا هي قوية: القدرة على الكشف عن بدء تشكيل مستعمرة التجاعيد، وبالتالي تقييم تطور مع الوقت نهج بطبيعة الحال، تتعزز بشكل كبير من خلال استخدام مجهر تشريح. ومع ذلك، إذا كانت هذه التكنولوجيا غير متوفرة، ويمكن تكييفها لبروتوكول للاستخدام مع غيرها من المعدات، بما في ذلك كاميرا رقمية بسيطة، مع التركيز التكبير. في حين أن هذا البروتوكول يركز على تقييم تنمية مستعمرة التجاعيد، يمكن أيضا أن يكون تعديل لتقييم تكوين غشاء رقيق، وهو شكل من بيوفيلم أن يتطور عندما الخلايا تنمو بشكل ثابت في ثقافة السائل. قد يكون هذا البروتوكول يثبت أيضا مفيدة في تقييم المؤشرات الأخرى من تشكيل بيوفيلم، بما في ذلك إدراج الأصباغ محددة في المستعمرات رصدت خلال تطوير بيوفيلم. وتشمل هذه، ولكنها لا تقتصر على والأصباغ مثل الأحمر والكونغو calcofluأو التي يمكن أن تربط إلى السليلوز، وهو عنصر مشترك من الأغشية الحيوية البكتيرية 16. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول، على الرغم من أن وضعت للاستخدام مع خامسا على سبيل المثال لا fischeri، لهذا الكائن الحي ولكن يمكن تعميمها على دراسة تشكيل بيوفيلم في الكائنات عديدة مختلفة، مثل العصوية الرقيقة 4، الضمة الكوليرية 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، والزائفة الزنجارية 7، والتي تشكل كل معرض مستعمرة التجاعيد. وأخيرا، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة morphologies مستعمرة الأخرى التي لها نمط النمو، مثل، ربما، والزخرفة التي تحدث أثناء نمو زانثس Myxococcus 17 و جوي تطوير هيكل في الزائفة الزنجارية 18. هذا البروتوكول هو بالتالي من استخدام العام للباحثين علم الأحياء المجهرية وبيوفيلم.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> زييس stemi 2000-C تشريح مجهر </td><td> زييس </td><td> 45505300000000000 </td><td> (الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> بروخرس C10 PLUS </td><td> JENOPTIK بصري أنظمة شركة محدودة </td><td> 017953-602-26 </td><td> كاميرا المرفق (التي تم الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> CL 1500 EC الباردة مصدر الضوء </td><td> زييس </td><td> 4355400000000000 </td><td> (الحصول عليها من خلال مجهر لوكاس) </td></tr><tr><td> بروخرس CapturePro </td><td> JENOPTIK بصري أنظمة شركة محدودة </td><td> البرمجيات الحرة مع الكاميرا المسجلة </td><td> برنامج كمبيوتر لالتقاط الصور </td></tr><tr><td> صورة J </td><td> المعاهد الوطنية للصحة </td><td> البرمجيات الحرة من:ط / download.html &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> برنامج كمبيوتر لقياس قطرها </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

الأغشية الحيوية، أو سطح المرفقة المجتمعات من خلايا مغلفة في المصفوفة خارج الخلية، وتمثل نمط حياة مشتركة لالعديد من أنواع البكتيريا. في غضون بيوفيلم، الخلايا البكتيرية في كثير من الأحيان معرض للتغيير علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك تعزيز المقاومة للمضادات الحيوية وغيرها من الضغوط البيئية 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأغشية الحيوية تلعب دورا هاما في استضافة ميكروب التفاعلات. الأغشية الحيوية تتطور عندما البكتيريا الانتقال من الفردية، وخلايا العوالق لتشكيل معقدة، متعددة الخلايا المجتمعات 2. في المختبر، يتم دراسة الأغشية الحيوية من خلال تقييم تطور الظواهر بيوفيلم محددة. النمط الظاهري بيوفيلم مشترك ينطوي على تشكيل مستعمرات البكتيريا التجاعيد أو مغضن على أجار صلب وسائل الإعلام 3. التجاعيد تشكيل مستعمرة يوفر وسيلة بسيطة للغاية ومفيدة لتحديد وتوصيف سلالات بكتيرية واظهار الظواهر بيوفيلم تتغير، والتحقيق في الظروف البيئية التي تؤثر على تشكيل بيوفيلم. WRInkled تشكيل مستعمرة تخدم كمؤشر على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا إيجابية الجرام على حد سواء، مثل العصوية الرقيقة 4، والبكتيريا سالبة الجرام، مثل الكوليرا الضمة 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، الزائفة الزنجارية 7، و الضمة fischeri 8. هذه البكتيريا البحرية V. لقد أصبح fischeri نموذجا لتشكيل بيوفيلم نظرا للدور الحاسم من خلال الأغشية الحيوية الاستعمار المضيف: الأغشية الحيوية التي تنتجها V. fischeri تعزيز استعمارها من هاواي قصير الذيل 8-10 الحبار scolopes Euprymna. الأهم من ذلك، لاحظ الظواهر بيوفيلم في المختبر ترتبط قدرة V. خلايا fischeri لاستعمار على نحو فعال الحيوانات المضيف: سلالات ضعاف لتشكيل بيوفيلم في المختبر تملك عيب الاستعمار 9،11، في حين زادت الضغوط العارضةوتتعزز الظواهر بيوفيلم عن الاستعمار 8،12. V. fischeri بالتالي يوفر النظام نموذج بسيط لتقييم الآليات التي تنظم تشكيل بيوفيلم البكتيريا وكيف الأغشية الحيوية تأثير الاستعمار المضيف. في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri كنظام نموذج. هذا الأسلوب ينطوي على الحذر اكتشاف الثقافات البكتيرية بتركيزات محددة وحدات التخزين على وسائط أجار الصلبة؛ ثقافة المرقطة هو مرادف لمستعمرة بكتيرية واحدة. ويمكن استخدام هذه التقنية &quot;ثقافة رصدت&quot; للمقارنة بين الظواهر بيوفيلم الإجمالي في، واحد نقاط محددة من الوقت (نقطة النهاية المقايسات)، أو لتحديد وتوصيف الظواهر بيوفيلم خفية من خلال الوقت طبعا المقايسات للتنمية بيوفيلم وقياسات القطر مستعمرة ، ويتأثر التي كتبها تشكيل بيوفيلم. وبالتالي، هذا الأسلوب يوفر تحليل شبه كمي لتشكيل بيوفيلم، فيmitting تقييم للتوقيت والزخرفة للتنمية مستعمرة التجاعيد والحجم النسبي للبنية النامية، والخصائص التي تمتد إلى ما بعد التشكل مجمل بسيط.

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development at JoVE.com

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

ونحن نقدم بسيطة، وشبه كمي للتحقيق في طريقة تشكيل بيوفيلم<em&gt; في المختبر</em&gt;. هذا الأسلوب يستفيد من stemi زايس 2000-C تشريح مجهر (مرفق مع الكاميرا) لمراقبة كلا من توقيت ونمط تشكيل بيوفيلم، وفقا لتقييم وضع المستعمرات التجاعيد.

مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K Views.  Loyola University Medical Center. ونحن نقدم بسيطة، وشبه كمي للتحقيق في طريقة تشكيل بيوفيلم في المختبر. هذا الأسلوب يستفيد من stemi زايس 2000-C تشريح مجهر (مرفق مع الكاميرا) لمراقبة كلا من توقيت ونمط تشكيل بيوفيلم، وفقا لتقييم وضع المستعمرات التجاعيد.

Video: A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

تشكيل مستعمرة الفحص لينة آجار

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots located in Xinjiang Province, northwest China. To prevent high correlations among observations from the same sampling unit, we developed the model using a linear mixed-effects approach with random plot effect to account for stochastic variability. Various tree- and stand-level variables, such as indices for tree size, competition, and site condition, were included as fixed effects to explain the residual variability. In addition, heteroscedasticity and autocorrelation were described by introducing variance functions and autocorrelation structures. The optimal linear mixed-effects model was determined by several fit statistics: Akaike&#8217;s information criterion, Bayesian information criterion, logarithm likelihood, and a likelihood ratio test. The results indicated that significant variables of individual-tree basal area increment were the inverse transformation of diameter at breast height, the basal area of trees larger than the subject tree, the number of trees per hectare, and elevation. Furthermore, errors in variance structure were most successfully modeled by the exponential function, and the autocorrelation was significantly corrected by first-order autoregressive structure (AR(1)). The performance of the linear mixed-effects model was significantly improved relative to the model using ordinary least squares regression.

Mixed-effects models are flexible and useful tools for analyzing data with a hierarchical stochastic structure in forestry and could also be used to significantly improve the performance of forest growth models. Here, a protocol is presented that synthesizes information relating to linear mixed-effects models.

تطوير نموذج زيادة منطقة القاعدية الفردية -شجرة باستخدام نهج مختلط الخطي

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the surface and disaggregating the clumps, and analyzing the sample. Of the four steps, harvesting and disaggregation are the least studied but nonetheless critical when considering the potential for test bias. This article demonstrates commonly used harvesting and disaggregation techniques for biofilm grown on three different surfaces. The three biofilm harvesting and disaggregation techniques, gleaned from an extensive literature review, include vortexing and sonication, scraping and homogenization, and scraping, vortexing and sonication. Two surface types are considered: hard non-porous (polycarbonate and borosilicate glass) and porous (silicone). Additionally, we provide recommendations for the minimum information that should be included when reporting the harvesting technique followed and an accompanying method to check for bias.

This paper details methods that demonstrate three common biofilm harvesting and disaggregation techniques on two surface types, ruggedness testing of a harvesting method and minimum information to consider when choosing and optimizing harvesting and disaggregation techniques to increase reproducibility.

الحصاد والتصنيف: خطوة مهملة في أبحاث أساليب البيوفيلم

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

تقييم تكوين الأغشية الحيوية الراكدة وتوصيف الأغشية الحيوية

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول شامل لقياس وتقييم وتصور الأغشية الحيوية الراكدة 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

القياس الكمي وتقييم الجدوى واستراتيجيات التصور للأغشية الحيوية الراكدة

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...