1. جمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات الدم من الأفراد للموافقة المسبقة عن المناسبة. لكل فرد، واستخلاص 4-5 مل من الدم في أنبوب P100 (تشخيص دينار بحريني، فرانكلين بحيرة، NY، الولايات المتحدة الأمريكية). لأغراض المقارنة، في وقت واحد جمع الدم في أنبوب EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. كما أنها تحتوي على فاصل الميكانيكية. بعد جمع الدم كله، والحفاظ على حد سواء الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة ليلة وضحاها حتى يحدث معالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في BD P100 أنابيب في 2،500 ز لمدة خمسة عشر دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل البلازما التي تم جمعها فوق فاصل الميكانيكية إلى أنابيب الطرد المركزي الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين P100 الأنابيب، الذي يحتوي على الدم ضغط دون فاصل، في -80 درجة مئوية حتى كنت على استعداد لبدء تحويلة DNAraction. </li></ol> 2.1 من دم P100 أنبوب (P100_DNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخزين أنابيب P100 في -80 درجة مئوية بعد استخراج البلازما. في غضون 3 إلى 4 أشهر، استرداد أنبوب P100 يحتوي على الدم المضغوط من الفريزر وذوبان الجليد عند 37 درجة في حمام مائي لمدة 5 دقائق (الشكل 1A). إزالة أي البلازما المتبقية التي يجلس فوق فاصل. إضافة 2 مل من 17٪ محلول السكروز (التدرج حل اختبارها في المنزل - بيانات غير منشورة) في P100 أنابيب فوق الفاصل (1B الشكل). أنابيب الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في 2،500 غرام؛ هذه العملية يدفع فاصل الميكانيكية إلى الأعلى من الأنبوب وينتج ثلاث طبقات من حل بما في ذلك معطف الشهباء (الشكل 1C). استخراج فاصل باستخدام مشبك معدني steriled الجزاء (1D الشكل) يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استرداد الفاصل الميكانيكية من كل أنبوب (1D الشكل)، وإزالة وdiscarد طبقة السكروز أعلى. نقل الطبقة الوسطى، التي تمثل طبقة معطف الشهباء (BC)، في العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة الفوسفات عازلة المالحة (PBS) لزيادة حجم معطف الشهباء إلى 3 مل. استخراج الحمض النووي من معطف الشهباء باستخدام الكواشف من QIAGEN Puregene كيت الدم وفقا لتوصية الشركة الصانعة؛ باستثناء سرعة الطرد المركزي من 2،500 غرام (بدلا من 2،000 ز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لليز وإزالة خلايا الدم الحمراء (RBC)، إضافة 9 مل من تحلل RBC إلى 3 مل من معطف الشهباء. عكس كل أنبوب عدة مرات، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع قلب في بعض الأحيان أثناء الحضانة. تدور كل الخليط إلى أسفل في 2،500 ز لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. علاج بيليه المتبقية في كل أنبوب مع 3 مل من محلول تحلل الخلايا ودوامة لمدة 15 ثانية. علاج المحللة مع 1 مل من البروتين حل هطول الأمطار ودوامة لمدة 15 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 2،500 ز لمدة 5 دقائق ونقل طاف في أنبوب جديد 15 مل المخروطية التي تحتوي على3 مل من 100٪ الأيزوبروبانول. عكس أنابيب جديدة 10 مرات والطرد المركزي في 2500 ز لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من الايثانول 70٪. عكس أنابيب مخروطية عدة مرات لطرد وغسل بيليه الحمض النووي. الطرد المركزي في 2،500 ز لمدة 1 دقيقة. تسمح بيليه لتجف لمدة 3 دقائق (وضع أنبوب رأسا على عقب) في درجة حرارة الغرفة ثم وقف الحمض النووي مع 250 مل من محلول معالجة الجفاف عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ونقل إلى ما قبل المسمى 1.7 مل microtube. تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 2.2 من الدم من EDTA Ttube (EDTA_DNA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع الدم الكامل للاختبار الروتيني الدمويات المناعية في أنابيب بلاستيكية vaccutainer رذاذ المغلفة مع 10.8 ملغ من K 2 EDTA وتخزينها في -80 درجة مئوية. لأن لا تحتوي على أنابيب فاصل الميكانيكية، لا يشمل استخراج الحمض النووي الخطوات التي تنطوي على فاصل الميكانيكية (2.1.1 و 2.1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون 3 إلى 4 أشهر من تخزين الدم، وDNA يتم استخراج باستخدام الرفراف فليكس (الحرارية فيشر العلمية، التايم، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). وهو نظام استخراج الحمض النووي الأتمتة القائمة على التكنولوجيا الجسيمات المغناطيسية ويتكون من خلية تحلل / الحمض النووي ملزم، عدة خطوات غسل وشطف الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدة تستخدم في استخراج الحمض النووي هو الرفراف فليكس 24 DNA الدم مجموعة (QIAGEN، ألمانيا). </li></ol> 3. الحمض النووي الكمية وتقييم الجودة تم تقييم كمية ونوعية وسلامة الحمض النووي الجيني من خلال مزيج من الأسلوب الذي يشمل picogreen، والتحليل الطيفي الكهربي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد تركيز الحمض النووي الجيني عن طريق القياس الكمي معمل NanoDrop وpicogreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد نقاء من قياس 260/280 نسبة على معمل NanoDrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحميل العينة (500 نانوغرام) أيضا على 1٪ الاغاروز هلام لتقييم سلامة (تدهور) من الحمض النووي. </li></ol> 4. Genotypinز فحوصات وضبط الجودة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خمسة P100_DNA والعينات الخاصة EDTA_DNA المقابلة يتم اختيارهم عشوائيا لمزيد من التحليل باستخدام Immunochip مخصص (المناعية تحليل الحمض النووي BeadChip). Immunochip هو رقاقة التنميط الجيني Infinium تحتوي على 196524 الأشكال وتم تصميمها لإجراء دراسات مستمنع 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، يتم تضخيمه 200 نانوغرام من الحمض النووي، مجزأة، عجلت ومعلق في المخزن المؤقت التهجين المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تهجين العينات التشويه والتحريف على Immunochips في 48 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التهجين، تتم معالجة Immunochips لردود الفعل ملحق قاعدة واحدة والملون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تصويرها في immunochips باستخدام البورشيد Hiscan الخرزة قارئ مجموعة ويتم تحميل البيانات شدة حبة تطبيع في البرنامج GenomeStudio البورشيد وتحويلها إلى الأنماط الجينية. وتسمى المورثات باستخدام خوارزمية autocalling من GenomeStudio. مراقبة الجودة فيvolves استبعاد الأشكال المتعددة للتركيبات النووية المنفردة (النيوكلوتايد) مع سعر المكالمة &lt;95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم سعر المكالمة SNP كمقياس لكفاءة الفحص immunochip. يتم احتسابها كنسبة مئوية من مجموع عدد فحوصات على رقاقة (196524 النيوكلوتايد المشفرة على كل رقاقة) التي تحقق كثافة إشارة كافية ونوعية لتلقي واجب التركيب الوراثي الآلي. من المتوقع أن يحقق ما لا يقل عن سعر المكالمة نفس سيطرة الحمض النووي هاب ماب المدرجة في فحص الحمض النووي immunochip جودة عالية (260/280 نسبة 1.8 أو أعلى وعدم وجود تدهور). مراقبة الجودة ينطوي على استبعاد تعدد الأشكال مع سعر المكالمة &lt;95٪ في كل مجموعة بيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intrinsic+proteolytic+activities+moderates+preanalytical+variability+and+instability+of+human+plasma.">Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma.</a> Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).</li><li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood.">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).</li><li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing.">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).</li><li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood.">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).</li><li>Cortes, A., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promise+and+pitfalls+of+the+Immunochip.">Promise and pitfalls of the Immunochip.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13, 101 (2011).</li><li>Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+extraction+method+from+blood+clots+for+studies+requiring+both+host+and+viral+DNA.">An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA.</a> Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).</li><li>Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+preparation+of+genomic+DNA+from+easily+obtainable+clotted+blood.">Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood.</a> Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).</li><li>Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+genomic+DNA+purified+from+clotted+blood+samples+for+single+nucleotide+polymorphism+genotyping.">Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).</li><li>Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonenzymatic+extraction+of+DNA+from+blood+collected+into+serum+separator+tubes.">Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes.</a> Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).</li><li>Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+cryopreserved+clotted+human+blood.">Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood.</a> BioTechniques. 15, 18-20 (1993).</li><li>Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+DNA+isolation+from+clotted+blood+extricated+rapidly+from+serum+separator+tubes.">A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes.</a> Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).</li><li>Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+rapid+method+for+extraction+of+DNA+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood.">Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood.</a> Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).</li><li>Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedure+for+DNA+isolation+from+fresh+and+cryopreserved+clotted+human+blood+useful+in+clinical+molecular+testing.">Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing.</a> Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).</li><li>Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+sample+collection+and+storage+methods+for+multicenter+immunologic+research+in+children.">Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children.</a> Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).</li><li>Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+DNA+purification+from+samples+of+highly+clotted+blood.">A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood.</a> Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).</li><li>Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+points+in+mapping+autoimmunity.">Fine points in mapping autoimmunity.</a> Nature. 43, 1173-1174 (2011).</li><li>Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+newly+identified+loci+for+autoimmune+thyroid+disease.">Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

كثير من الأمراض التي تصيب الإنسان لها أسباب وراثية واستكشاف الأساس الجيني للمرض الإنسان تطالب زيادة الحمض النووي ذات جودة عالية. وanticoagulated المصدر الأكثر شيوعا من الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية الدم الكامل. لأن معظم المختبرات السريرية أداء اختبار الكيم?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD P100 tubes</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>366448</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA tubes</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>367863</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S9378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paper clip</td>
 <td>Office product</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430052</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Red blood cells (RBC)</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>158389 (kit)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30256.01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>940054</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.7 ml microtubes</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>MCT-175-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit</td>
 <td>Illumina</td>
 <td>WG-352-1001</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead array reader</td>
 <td>Illumina</td>
 <td>NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GenomeStudio Software</td>
 <td>Illumina</td>
 <td>N/A</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a practical and novel method to extract genomic dna from blood collection kits for plasma protein preservation

الاختبارات المعملية يمكن القيام به على الأجزاء الخلوية أو السوائل من الدم. استخدام مختلف أنابيب جمع الدم يحدد جزء من الدم الذي يمكن تحليلها (الدم الكامل، البلازما أو مصل). مختبرات تشارك في دراسة الأساس الجيني للاضطرابات الإنسان تعتمد على الدم الكامل anticoagulated جمعها في vacutainer المحتوية على EDTA-كمصدر من الحمض النووي للتحليل الجيني / الجيني. لأن معظم المختبرات السريرية أداء الكيمياء الحيوية، وإجراء اختبارات مصلية والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، ويتم جمع الدم anticoagulated أيضا في أنبوب يحتوي على الهيبارين-(أنبوب البلازما). لذلك عندما تكون هناك حاجة الحمض النووي والبلازما للتحليلات متزامنة ومتوازية من البيانات على حد سواء الجينومية والبروتين، فمن المعتاد أن جمع الدم في كل من EDTA والأنابيب الهيبارين. إذا يمكن جمع الدم في أنبوب واحد، ويكون بمثابة مصدر لكلا البلازما والحمض النووي، وستنظر هذه الطريقة على التقدم إلى المنهجيات القائمةالمواد المستنفدة للأوزون. استخدام الدم المضغوط بعد استخراج البلازما يمثل مصدرا بديلا للالحمض النووي الجيني، وبالتالي التقليل من كمية عينات الدم معالجتها والحد من عدد العينات المطلوبة من كل مريض. وهذا من شأنه في النهاية توفير الوقت والموارد. تم إنشاء نظام لجمع الدم P100 دينار بحريني لحفظ بروتين البلازما كما تحسن أسلوب أكثر من بلازما السابقة أو جمع المصل أنابيب 1، لتحقيق الاستقرار في محتوى البروتين من الدم، وتحسين واكتشاف العلامات البيولوجية البروتين والبروتينات التجريب من الدم البشري. وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل من K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. وهي تشمل أيضا فاصل الميكانيكية، الذي يوفر حاجز مادي بين البلازما والكريات الخلية بعد الطرد المركزي. وقد وضعت عدد قليل من الطرق لاستخراج الحمض النووي من الدم المتجلط SAmples جمعها في أنابيب البلازما القديمة 2-4. وارتبطت التحديات من هذه الأساليب أساسا مع نوع من الفاصل داخل الأنابيب (هلام الفاصل) وشملت صعوبة في استرداد الدم المتجلط، وإزعاج من تفتيت أو تشتيت كلوت، وعرقلة استخراج كلوت بواسطة الجل الفصل. نقدم الأسلوب الأول الذي يستخرج وينقي الحمض النووي الجيني من الدم تعادل في BD أنابيب P100 جديدة. قارنا نوعية عينة من الحمض النووي من P100 إلى أن أنابيب من أنابيب EDTA. نهجنا هو بسيطة وفعالة. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية كما يلي: 1) استخدام BD P100 البلازما (تشخيص BD، سباركس، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) أنبوب مع فاصل الميكانيكية لجمع الدم، 2) إزالة الفاصل الميكانيكية باستخدام مزيج من السكروز وعلى العقيمة هوك مشبك معدني، 3) الفصل بين طبقة معطف الشهباء تحتوي على خلايا بيضاء و 4) عزل الحمض النووي الجيني منمعطف الشهباء باستخدام الحمض النووي تجارية عدة استخراج العادية أو بروتوكول قياسي مماثل.

تقييم الجودة وقياس تركيز الحمض النووي وكانت غلة P100_DNAs أقل بكثير من تلك التي EDTA_DNAs (الجدولان 1 و 2). نقاء الحمض النووي التي يمثلها قيمة 260/280 النسبة مشابهة لكلا P100_DNA وEDTA_DNA عينة مجموعة (الجدولان 1 و 2). ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation at JoVE.com

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

نحن تصف طريقة جديدة لعزل الحمض النووي الجيني من الدم الكامل التي جمعت لبلازما / الأمصال. بعد جمع البلازما، ويتم عادة تجاهل الدم المضغوط. يمثل طريقة لدينا رواية تحسنا كبيرا خلال الأساليب القائمة ويجعل الحمض النووي والبلازما المتاحة من مجموعة واحدة، دون طلب دم إضافية.

طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

a-practical-novel-method-to-extract-genomic-dna-from-blood-collection

Research

JoVE Journal

Biology

41.9K Views.  Emory University School of Medicine and Children's Health Care of Atlanta. نحن تصف طريقة جديدة لعزل الحمض النووي الجيني من الدم الكامل التي جمعت لبلازما / الأمصال. بعد جمع البلازما، ويتم عادة تجاهل الدم المضغوط. يمثل طريقة لدينا رواية تحسنا كبيرا خلال الأساليب القائمة ويجعل الحمض النووي والبلازما المتاحة من مجموعة واحدة، دون طلب دم إض?...

Video: A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

كوكتيل من الدم والسرطان حدوة الحصان الأميركي ، الليمول Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

دليل عملي لPhylogenetics لNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the potential of targeting the kinase in cancers by effectively treating the CML patients. This observation revolutionized drug development to target the oncogenic kinases implicated in various other malignancies, such as, EGFR, B-RAF, KIT and PDGFRs. However, one major drawback of anti-kinase therapies is the emergence of drug resistance mutations rendering the target to have reduced or lost affinity for the drug. Understanding the mechanisms employed by resistant variants not only helps in developing the next generation inhibitors but also gives impetus to clinical management using personalized medicine. We reported a retroviral vector based screening strategy to identify the spectrum of resistance conferring mutations in BCR/ABL, which has helped in developing the next generation BCR/ABL inhibitors. Using Ruxolitinib and JAK2 as a drug target pair, here we describe in vitro screening methods that utilizes the mouse BAF3 cells expressing the random mutation library of JAK2 kinase.

Emergence of genetic resistance against kinase inhibitor therapy poses significant challenge for effective cancer therapy. Identification and characterization of resistant mutations against a newly developed drug helps in better clinical management and next generation drug design. Here, we describe our protocol for in vitro screening and validation of resistant mutations.

وهناك طريقة لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة ضد كيناز مثبطات

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...